陳珊珊，丁 丞，郭立新，馬曉東，林 燕

（中國農(nóng)業(yè)大學理學院，北京 100193）

氟 蟲 腈 （fipronil），商 品 名 為 銳 勁 特 （regent），化學名稱為（RS）－5－氨基－1－（2，6－二氯－4a－三氟甲基苯基）－4－三氟甲基亞磺?；吝颍?－腈，是拜耳作物科學公司（原羅納普朗克農(nóng)化公司）于1987年開發(fā)研制的苯基吡唑類新型廣譜殺蟲劑。氟蟲腈及其主要代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)式示于圖1。大量試驗數(shù)據(jù)和生產(chǎn)實踐表明，氟蟲腈具有高效、低毒、殺蟲譜廣等優(yōu)點。然而，氟蟲腈及其代謝物對許多水生生物毒性高［1］，尤其是甲殼類動物，如蝦、蟹的96h致死中濃度（LC50）僅為1.0～8.6μg／L［2］，因此對環(huán)境生態(tài)和養(yǎng)殖業(yè)造成極大的威脅。此外，氟蟲腈水解半衰期長達135d，脂溶性強，易在水生生物中富集。我國南方水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘多被農(nóng)田環(huán)繞，農(nóng)田施藥時極微量的氟蟲腈漂移入水體后經(jīng)魚蝦富集會影響水產(chǎn)品質(zhì)量，甚至造成蝦、蟹死亡［3］。因此需要靈敏度高、選擇性強的分析方法監(jiān)測水環(huán)境及水生生物中超痕量氟蟲腈及其代謝物。

圖1 氟蟲腈及其主要代謝產(chǎn)物的化學結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of the fipronil and its metabolites

目前，一般采用 GC／ECD、LC／MS、GC／MS（EI）等方法測定環(huán)境或生物樣品中氟蟲腈及其代謝物殘留量，檢測限為0.3～10μg／kg［4－20］，該靈敏度不能滿足痕量氟蟲腈及其主要代謝物測定的要求。例如，雖然GC／ECD對含有多個氟原子的氟蟲腈及其代謝物標準品靈敏度很高，但是因為環(huán)境樣品中大量含氧、硫等雜原子的干擾物使其信噪比降低，LC／MS、GC／MS（EI）方法也無法檢出極低含量的氟蟲腈。

本研究采用氣相色譜－負化學電離－質(zhì)譜（GC－NCI／MS）聯(lián)用法解決水和蝦體樣品中基質(zhì)的干 擾 問 題［20］，使 氟 蟲 腈 及 其 代 謝 產(chǎn) 物MB46513、MB45950、MB46136的檢出限大為降低，以滿足氟蟲腈環(huán)境風險評估的需求。并用此方法確證蝦富集漂移到養(yǎng)殖池塘中痕量氟蟲腈死亡的現(xiàn)象，為農(nóng)藥安全使用及管理提供依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

氟蟲腈及其代謝物 MB46513、MB45950、MB46136農(nóng)藥標準品：德國拜耳作物科學公司產(chǎn)品；丙酮、甲醇、正己烷、二氯甲烷、乙腈、氯化鈉、無水硫酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（均為分析純）：北京化工廠產(chǎn)品；環(huán)己烷（色譜純）：美國Acros Organics公司產(chǎn)品；石墨化炭黑SPE柱（150～200目，0.3g）、復(fù)合SPE柱（60～100目弗羅里硅土0.5g、石墨化炭黑0.3g）：實驗室自制，使用前用10mL二氯甲烷預(yù)淋洗；純水（R≥18MΩ）：實驗室自制。

均質(zhì)機：廣州IKA Works公司產(chǎn)品；Vortex－5渦旋儀：海門市其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；Sigma 2－5離心機：德國Sigma公司產(chǎn)品；RE－52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；HGC－12氮吹儀：恒奧科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；KQ－250DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；Perkin－Elmer Clarus 600GC／MS氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國Perkin－Elmer公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 水樣的制備 水樣過濾除去水草等雜物后，取200.0mL于500mL分液漏斗中，加入5g NaCl，分別用50、40、40mL二氯甲烷萃取3次，收集二氯甲烷萃取液，濃縮近干。將濃縮后的樣品轉(zhuǎn)移至石墨化炭黑SPE柱上，用15 mL二氯甲烷淋洗，收集淋洗液于30℃濃縮近干，N2吹干后，用環(huán)己烷定容至1mL，待進樣。

1.2.2 蝦樣的制備 準確稱取5.0g蝦樣于100mL離心管中，加入5g氯化鈉，用140mLV（丙酮）∶V（二氯甲烷）＝3∶4的溶液分2次提取，每次以10 000r／min均質(zhì)1min，3 000 r／min離心后，將全部提取液轉(zhuǎn)移至250mL分液漏斗中，加入15mL 0.1mol／L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4），振搖后，靜置分層除去蛋白質(zhì)；將上層提取液經(jīng)無水硫酸鈉除水后濃縮近干，濃縮后的樣品用50mL正己烷溶解并轉(zhuǎn)移至500mL分液漏斗中，用40mL乙腈萃取3次，收集乙腈萃取液，濃縮蒸發(fā)近干；再用5mL二氯甲烷溶解樣品，并全部轉(zhuǎn)入到復(fù)合SPE柱中，繼而用20 mL二氯甲烷淋洗，收集全部25mL二氯甲烷溶液，濃縮蒸發(fā)近干，N2吹干后，用環(huán)己烷定容至1mL，待測定。

1.2.3 色譜條件 載氣 （氦氣）流速：1 mL／min；色譜柱：DB－5（30m×0.25mm×0.25 μm）；進樣口溫度：250℃；程序升溫：初始溫度60℃，以25.0℃／min升至220℃，再以10.0℃／min升至260℃，保持4min，以20.0℃／min升至270℃，保持10min；不分流進樣，進樣量1μL。

1.2.4 質(zhì)譜條件 檢測方法1（NCI）：傳輸線溫度250℃；源溫220℃；負化學電離，反應(yīng)氣為甲烷，選擇離子檢測，氟蟲腈及其代謝物的質(zhì)譜掃描參數(shù)列于表1。

檢測方法2（EI，用于靈敏度比較）：傳輸線溫度250℃；源溫200℃；選擇離子檢測，氟蟲腈及其代謝物的質(zhì)譜掃描參數(shù)列于表2。

表1 氟蟲腈及其代謝物的GC－MS／NCI／SIM選擇離子Table 1 Representative ions for fipronil and its metabolites in GC－MS／NCI／SIM quantification

表2 氟蟲腈及其代謝物的GC－MS／EI／SIM選擇離子Table 2 Representative ions for fipronil and metabolites in GC－MS／EI／SIM quantification

1.2.5 標準曲線的建立 分別提取空白水樣或空白蝦樣，用提取液配制基質(zhì)標準液，水樣基質(zhì)標準液系列濃度為 2、5、10、25、50、100、200 μg／L，蝦樣基質(zhì)標準液系列濃度為1、2、5、10、25、50μg／L，用GC－MS（NCI／SIM）檢測，建立標準曲線。

1.2.6 添加回收率的測定 取200.0mL空白水樣或5g空白蝦樣添加工作標準溶液，水樣中添加濃度為0.01μg／L和1μg／L，蝦樣中添加濃度為0.4μg／kg和2μg／kg。按照上述方法分析檢測，重復(fù)5次，計算方法的回收率和相對標準偏差。

1.2.7 樣品的測定 樣品采自浙江平湖一養(yǎng)殖場中的池塘水和蝦，樣品按照1.2.1和1.2.2進行前處理，按照1.2.3和1.2.4進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC－MS／NCI／SIM 和 GC－MS／EI／SIM 方法的比較

分別用 GC－MS／NCI／SIM 和 GC－MS／EI／SIM方法分析濃度為20μg／L氟蟲腈及其代謝物標準品。采用EI測定時，除MB46513外，其它組分勉強出峰，示于圖2。采用NCI測定時，各組分的峰型良好，信噪比分別是MB46513為44 270，MB45950為8 156，氟蟲腈為10 045，MB46136為50 249，示于圖3。由于含有多個鹵原子，氟蟲腈及其代謝物的電負性極強，適用于NCI測定，同時樣品溶劑和儀器本底中氧、硫等雜原子響應(yīng)值低，由此提高了信噪比。這種選擇性在基質(zhì)干擾強的水樣和蝦樣中更明顯，故選擇NCI電離方式。

在農(nóng)藥暴露量分析中，一般選擇數(shù)個特征離子檢測目標化合物。氟蟲腈及其代謝物含2個氯原子，質(zhì)譜圖中可見含氯原子的同位素離子簇。如含1個氯原子的同位素離子簇：m／z384和386、m／z352和354，其豐度比均為3∶1；含2個氯原子的同位素離子簇：m／z366和368、m／z383和385，豐度比均為9∶6。這些含氯碎片的離子對作為檢測所用的特征離子，其質(zhì)荷比及豐度比結(jié)合色譜保留時間，對于鑒定氟蟲腈及其代謝物有重要意義。

圖2 氟蟲腈及其代謝物GC－MS／EI／SIM色譜圖及質(zhì)譜圖Fig.2 GC－MS／EI／SIM chromatograms and mass spectrogram of fipronil and its metabolites

2.2 標準曲線的建立

選擇豐度高且無干擾的離子作為定量離子。由于氟蟲腈及其代謝物具有明顯的基質(zhì)效應(yīng)，在水樣和蝦樣的檢測中用基質(zhì)標準曲線定量，其線性方程列于表3。氟蟲腈及其代謝物的水樣基質(zhì)標準曲線在2～200μg／L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；蝦樣基質(zhì)標準曲線在1～50μg／L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 準確度和精密度

向空白水樣和蝦樣中添加氟蟲腈及其代謝物標準品，添加水平分別為0.01、1μg／L（水）和0.4、2μg／kg（蝦），用該方法分析，實驗重復(fù)5次。在如此低的濃度下，各組分添加回收率在78%～120%之間，相對標準偏差小于15%，結(jié)果列于表4。實驗結(jié)果說明，該方法的準確度和精密度符合暴露量檢測要求。

圖3 氟蟲腈及其代謝物GC－MS／NCI／SIM色譜圖及質(zhì)譜圖Fig.3 GC－MS／NCI／SIM chromatograms and mass spectrogram of fipronil and its metabolites

表3 氟蟲腈及其代謝物的基質(zhì)標準曲線方程和相關(guān)系數(shù)Table 3 Liner regression equation and correlation coefficients of fipronil and its metabolites

表4 氟蟲腈及其代謝物的加標回收率Table 4 Recovery of fipronil and its metabolites in spiked water pond and shrimp sample

與文獻報道的分析方法中涉及的樣品基質(zhì)相比，蝦塘水及蝦基質(zhì)比較特殊。蝦塘水中會有較多的水草及藻類，樣品用二氯甲烷提取后，再用石墨化炭黑去除水藻色素。蝦樣采用的提取劑為V（丙酮）∶V（二氯甲烷）＝3∶4的溶液，用磷酸鹽緩沖液去除蛋白，然后用正己烷－乙腈溶劑除去大部分油脂，殘存的油脂和色素等雜質(zhì)用復(fù)合SPE柱除去。以上樣品凈化方法結(jié)合負化學電離選擇離子檢測，提高了方法的選擇性和靈敏度；氟蟲腈及其代謝物在水中的檢測限為0.01μg／L，在蝦中的檢測限為0.4μg／kg。

2.4 樣品測定

在浙江平湖地區(qū)稻田噴施氟蟲腈10天后，在距離稻田50m外的蝦塘中發(fā)現(xiàn)了病蝦和死蝦，用所建立的方法檢測其中的藥劑及其代謝物的暴露量，結(jié)果列于表5。

表5 氟蟲腈及其代謝物在蝦塘水及蝦中的暴露量Table 5 The residual of fipronil and its metabolites in water pond and shrimp

由于 GC－MS／NCI／SIM 靈敏度高、選擇性好，即使噴施氟蟲腈10天后，在距稻田50m外的蝦塘水體及蝦中均能檢出痕量氟蟲腈及其代謝物。其中 MB46513在水中檢出0.01～0.02 μg／L，在蝦中檢出7.2～12.2μg／kg；MB45950在水中的檢出小于0.01～0.01μg／L，在蝦中檢出3.0～3.2μg／kg；氟蟲腈在水中檢出0.01～0.09μg／L，在 蝦 中 檢 出 4.5～5.2μg／kg；MB46136在水中檢出0.01～0.02μg／L，在蝦中檢出26.3～50.5μg／kg。

參 考 OECD（Organization for Economic Co－operation and Development）關(guān)于生物富集系數(shù)的計算方法，采用池塘水中氟蟲腈及其代謝物總暴露量的平均值作為水中農(nóng)藥的濃度值，對蝦樣品進行富集倍數(shù)（BCF）值的計算，結(jié)果列于表6。

式中：BCF為生物富集系數(shù)；Cfs為蝦體內(nèi)的農(nóng)藥暴露量（μg／kg）；Cws為水體中的農(nóng)藥暴露量（μg／L）。

表6 氟蟲腈及其代謝物在蝦體內(nèi)的富集倍數(shù)Table 6 The BCF10dof fipronil and its metabolites in shrimp

蝦樣品中，S－1～S－3為蝦塘中死蝦，S－4～S－6為活蝦。從實驗結(jié)果可以看出，樣品S－1～S－3中氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物的暴露量均高于樣品S－4～S－6。從BCF值的計算結(jié)果可以看出，死蝦的BCF值為1 293～1 164，活蝦的BCF值為909～745。通過實驗發(fā)現(xiàn)，雖然養(yǎng)殖塘中水體與稻田并不連通，但稻田噴藥時漂移到水塘中痕量的氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物在蝦體中富集，經(jīng)過一段時間后使蝦的抵抗力減弱，從而生病并死亡。

3 結(jié)論

建立了氣相色譜－負化學電離－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測水樣和蝦樣中氟蟲腈及其3種主要代謝物，該方法的準確度、精密度及靈敏度均達到了環(huán)境風險評價和農(nóng)藥暴露量分析的要求。應(yīng)用該方法對實際樣品進行檢測發(fā)現(xiàn)，氟蟲腈及其主要代謝產(chǎn)物的總量在蝦體中的富集系數(shù)高達1 040。

［1］ GUNASEKARA A S，TRUONG T，GOH K S，et al.Tjeerdema environmental fate and toxicology of fipronil［J］.Journal of Pesticide Science，2007，32（3）：189－199.

［2］ 徐海娟，趙聯(lián)朝，劉國光.銳勁特對原生動物群落的急性毒性試驗［J］.環(huán)境化學，2004，23（4）：427－430.XU Haijuan，ZHAO Lianchao，LIU Guoguang.The acute toxicity effects of fipronil on freshwater protozoa community［J］.Environmental Chemistry，2004，23（4）：427－430（in Chinese）.

［3］ 王習達，陳 輝.銳勁特對水產(chǎn)養(yǎng)殖生物的影響［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008，16：287.WANG Xida，CHEN Hui.Effect of fipronil on aquaculture organisms［J］.Modern Agricultural Science and Technology，2008，16：287（in Chinese）.

［4］ KANDAR A，F(xiàn)AUCON J P.Determination of traces of fipronil and its metabolites in pollen by liquid chromatography with electrospray ionizationtandem mass spectrometry［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54（26）：9 741－9 746.

［5］ PIRARD C，WIDART J，NGUYEN B K，et al.Development and validation of a multi－residue method for pesticide determination in honey using on－column liquid－liquid extraction and liquid chromatography－tandem mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography A，2007，1 152（1／2）：116－123.

［6］ LIU D H，WANG P，ZHU W D，et al.Enantioselective degradation of fipronil in Chinese cabbage（Brassica pekinensis）［J］.Food Chemistry，2008，110（2）：399－405.

［7］ BICHONA E，RICHARDB C A，BIZEC B L.Development and validation of a method for fipronil residue determination in ovine plasma using 96－well plate solid－phase extraction and gas chromatography－tandem mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography A，2008，1 201（1）：91－99.

［8］ JIMéNEZ J J，BERNAL J L，del NOZAL M J，et al.Sample preparation methods to analyze fipronil in honey by gas chromatography with electron－capture and mass spectrometric detection［J］.Journal of Chromatography A，2008，1 187（1／2）：40－45.

［9］ JIMéNEZ J J，BERNAL J L，del NOZAL M J，et al.Comparative study of sample preparation procedures to determine fipronil in pollen by gas chromatography with mass spectrometric and electroncapture detection［J］.Journal of Chromatography A，2007，1 146（1）：8－16.

［10］ VíLCHEZ J L，PRIETO A，ARAUJO L，et al.Determination of fipronil by solid－phase microextraction and gas chromatography－mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography A，2001，919（1）：215－221.

［11］ MOHAPATRA S，DEEPA M，JAGDISH G K，et al.Fate of fipronil and its metabolites in／on grape leaves，berries and soil under semi arid tropical climatic conditions［J］.Bull Environ Contam Toxicol，2010，84（5）：587－591.

［12］ 丁立平.茶葉中氟蟲腈殘留量的測定［J］.分析測試技術(shù)與儀器，2010，16（3）：191－194.DING Liping.Uncertainty of measurement of fipronil in tea by gas chromatography－mass spectrometry［J］.Analysis and Testing Technology and Instruments，2010，16（3）：191－194（in Chinese）.

［13］ 丁 明，鐘冬蓮，湯富彬，等.固相萃取－高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用測定竹筍中殘留的7種殺蟲劑農(nóng)藥［J］.色譜，2013，31（2）：117－121.DING Ming，ZHONG Donglian，TANG Fubin，et al.Determination of seven pesticide residues in bamboo shoots by high performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry coupled with solid－phase extraction ［J］.Chinese Journal of Chromatography，2013，31（2）：117－121 （in Chinese）.

［14］ 付曉芳，林雁飛，李 晶，等.茶葉中氟蟲腈殘留量的檢測［J］.食品科學，2010，31（10）：279－282.FU Xiaofang，LIN Yanfei，LI Jing，et al.Gas chromatographic determination of fipronil residue in tea［J］.Chinese Journal of Food Science，2010，31（10）：279－282（in Chinese）.

［15］ 胡貝貞，蔡海江，宋偉華.茶葉中氟蟲腈等8種農(nóng)藥殘留的液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定及不確定度評定［J］.色譜，2012，30（9）：889－895.HU Beizhen，CAI Haijiang，SONG Weihua.Determination of eight pesticide residues in tea by liquid chromatography－tandem mass spectrometry and its uncertainty evaluation［J］.Chinese Journal of Chromatography，2012，30（9）：889－895（in Chinese）.

［16］ 唐 俊，操海群，花日茂，等.氣質(zhì)聯(lián)用測定食用菌中農(nóng)藥殘留［J］.安徽農(nóng)藥大學學報，2011，38（4）：549－553.TANG Jun，CAO Haiqun，HUA Rimao，et al.A multiresidue screening method for the determination of pesticides in edible fungi［J］.Journal of Anhui Agricultural University，2011，38（4）：549－553（in Chinese）.

［17］ 楊瑤君，張知錦，高立明，等.氟蟲腈在竹筍中的殘留檢測與消解動態(tài)［J］.農(nóng)藥，2008，47（11）：826－833.YANG Yaojun，ZHANG Zhijin，GAO Liming，et al.Degradation and determination of the residue of fipronil in bamboo shoot［J］.Agrochemi－cals，2008，47（11）：826－833（in Chinese）.

［18］ 周曉冬，余 兵，胡 進.豆類蔬菜中氟蟲腈殘留分析方法的研究［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2007，26：211－214.ZHOU Xiaodong，YU Bing，HU Jin.An analytical method for determination of fipronil residue in leguminous vegetables［J］.Journal of Agro－Environment Science，2007，26：211－214（in Chinese）.

［19］ 周 昱，徐敦明，陳達捷，等.固相微萃取－氣相色譜法和氣相色譜法－質(zhì)譜法測定茶葉中氟蟲腈及其代謝物殘留［J］.色譜，2011，29（7）：656－661.ZHOU Yu，XU Dunming，CHEN Dajie，et al.Determination of fipronil and its metabolites in tea by solid－fhase microextraction coupled with gas chromatography and gas chromatographymass spectrometry［J］.Chinese Journal of Chromatography，2011，29（7）：656－661（in Chinese）.

［20］ 朱莉萍，朱 濤，潘玉香，等.氣相色譜法同時測定蔬菜及水果中多種農(nóng)藥殘留量［J］.分析化學，2008，36（7）：999－1 003.ZHU Liping，ZHU Tao，PAN Yuxiang，et al.Determination of different kinds of pesticide residues in vegetable by gas chromatography［J］.Chinese Journal of Analytical Chemistry，2008，36（7）：999－1 003（in Chinese）.