李永庫(kù)，劉衣南，呂琳琳，李曉靜，王 芬

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110161；2.鞍山師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 鞍山 114005；3.中州大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，河南 鄭州 450044）

有機(jī)酸是葡萄酒的主要成分之一，葡萄酒中的酸度主要由有機(jī)酸決定，有機(jī)酸的種類(lèi)、濃度與葡萄酒的類(lèi)型、品質(zhì)有很大關(guān)系，它們影響著葡萄酒的口感、色澤及生物穩(wěn)定性，因此，對(duì)葡萄酒中的有機(jī)酸進(jìn)行檢測(cè)十分重要。目前已有采用高效液相色 譜法［1－6］、離子 色譜法［7－9］、高 效 液相色譜－質(zhì)譜 聯(lián) 用 法［10］和 毛 細(xì) 管 電 泳 法［11－16］測(cè)定葡萄酒中多種有機(jī)酸含量的報(bào)道，但采用毛細(xì)管電泳－質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定葡萄酒中草酸、富馬酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸、抗壞血酸、酒石酸和乳酸尚未見(jiàn)報(bào)道。

毛細(xì)管電泳（CE）儀具有分離選擇性易調(diào)節(jié)、分離效率高、速度快、有機(jī)溶劑和樣品消耗少、樣品處理簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，已成為一種復(fù)雜樣品中痕量物質(zhì)的分析方法。毛細(xì)管電泳與質(zhì)譜聯(lián)用（CE／MS）可以克服常用的毛細(xì)管電泳－紫外檢測(cè)方法中靈敏度不高、定性能力差的不足，在一次分析中可同時(shí)得到組分遷移時(shí)間、分子質(zhì)量和碎片特征信息，為復(fù)雜樣品的定性、定量分析提供了一種強(qiáng)有力的手段［17］。但是，毛細(xì)管電泳常用的非揮發(fā)性表面活性劑和緩沖體系會(huì)降低大氣壓電噴霧電離源（ESI）的電噴霧效率和污染離子源［18－19］，限制了 CE／MS的聯(lián)用。而海美溴銨作為改性劑，能夠與毛細(xì)管內(nèi)壁形成比較牢固的吸附層，不易被緩沖液沖掉，從而大大減少了表面活性劑對(duì)樣品電離的影響［20］。實(shí)驗(yàn)表明，海美溴銨－醋酸銨緩沖體系對(duì)有機(jī)酸在ESI電離源的電離強(qiáng)度沒(méi)有明顯的影響。本研究擬建立毛細(xì)管電泳－電噴霧質(zhì)譜（CE－ESI－MS）測(cè)定葡萄酒中8種有機(jī)酸的方法，并應(yīng)用于實(shí)際樣品測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent HP3DCE毛細(xì)管電泳儀和1100 MSD TRAP SL 質(zhì)譜儀：美國(guó) Agilent公司產(chǎn)品，通過(guò)CE／MS噴霧組件連接；鞘流液：由Agilent1100等梯度泵和1∶100分流器提供；未涂層彈性石英毛細(xì)管（50μm×83cm）：河北永年銳豐色譜器件廠產(chǎn)品；Orion868型pH／ISE測(cè)試儀：美國(guó)奧立龍公司產(chǎn)品；Sartorius 215S電子天平：德國(guó)賽多利斯公司產(chǎn)品；Waters Pro Plus超純水儀：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品。

甲醇、乙腈、異丙醇（色譜純）：美國(guó)Fisher公司產(chǎn)品；氨水、醋酸、醋酸銨（分析純）：上海試劑一廠產(chǎn)品；海美溴銨（分析純）：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；草酸、富馬酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸、抗壞血酸、酒石酸、乳酸標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取各1.0mg草酸、富馬酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸、抗壞血酸、酒石酸和乳酸，用水溶解并定容至1mL容量瓶，得到1g／L各酸的儲(chǔ)備液。密封置于4℃下保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)用緩沖溶液稀釋至所需濃度。

1.3 樣品的制備

吸取20.0mL混合均勻的葡萄酒樣，以10 000r／min離心10min，除去不溶物，用緩沖溶液準(zhǔn)確定容至20.0mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后作為供試品溶液。

1.4 電泳分離條件

以40.0mmol／L醋酸銨（用1.0mol／L醋酸調(diào)至pH 4.5）為運(yùn)行緩沖溶液，未涂層彈性石英毛細(xì)管（50μm×80cm），壓力進(jìn)樣（5kPa×8s），分離電壓25kV，分離溫度25℃。毛細(xì)管柱插入質(zhì)譜前先活化，每天用0.1mol／L氫氧化鈉沖洗30min，然后分別用水、1.5mmol／L海美溴銨和緩沖溶液各沖洗3min。所有溶液使用前均經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，并用超聲波脫氣5min，同一緩沖溶液運(yùn)行3～4次后應(yīng)更換。

1.5 質(zhì)譜條件

電噴霧電離源（ESI源，負(fù)離子模式），在m／z50～200進(jìn)行全離子掃描，然后選擇m／z89.1（草酸）、115.1（富馬酸）、117.1（琥珀酸）、191.1（檸檬酸）、133.2（蘋(píng)果酸）、175.1（抗壞血酸）、149.0（酒石酸）和89.1（乳酸）帶負(fù)電荷的準(zhǔn)分子離子峰峰面積用于定量；毛細(xì)管電壓4.0 kV；噴霧氣（N2）壓力8.27×104Pa；干燥氣（N2）流速10L／min，溫度350℃；鞘液組成：30%異丙 醇 （含 3.0mmol／L 氨 水）；鞘 液 流速6μL／min。

2 結(jié)果與討論

2.1 電泳條件的優(yōu)化

2.1.1 表面活性劑的種類(lèi)和濃度對(duì)分離的影響

毛細(xì)管電泳法常用的表面活性劑有十二烷基三甲基溴化銨（DTAB）、十四烷基三甲基溴化銨（TTAB）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）等。但由于DTAB、TTAB和CTAB不易揮發(fā)，影響樣品的電離，大大降低了質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度，因此不能使用。而海美溴銨作為改性劑，其主要優(yōu)點(diǎn)是能形成比較牢固的吸附層，不易被緩沖液沖掉［20］。因此在將毛細(xì)管插入質(zhì)譜前先用海美溴銨沖洗，然后用緩沖溶液沖洗10min，可以大大減少表面活性劑對(duì)樣品電離的影響。

本研究考察了不同濃度的海美溴銨對(duì)有機(jī)酸遷移時(shí)間的影響，示于圖1。隨著海美溴銨濃度的增加，有機(jī)酸遷移時(shí)間減少。當(dāng)海美溴銨濃度大于2.0mmol／L時(shí)，檸檬酸和蘋(píng)果酸部分重疊；而當(dāng)海美溴銨濃度等于1.5mmol／L時(shí)，各酸的分離度和電離強(qiáng)度均較好。

圖1 海美溴銨濃度對(duì)遷移時(shí)間的影響Fig.1 Effect of hexadimethrine bromide concentration on the migration times

2.1.2 緩沖溶液pH值對(duì)分離的影響 有機(jī)酸為弱酸，其pKa值大多在2～6之間，有機(jī)酸的有效遷移率大小在很大程度上取決于緩沖液的pH值。因此緩沖溶液的pH值是影響毛細(xì)管電泳分離的關(guān)鍵因素，pH值的改變將引起電滲流（EOF）、峰形及分離度的變化。本研究在pH 3～7的范圍內(nèi)考察緩沖溶液的pH值對(duì)分離情況的影響，示于圖2。結(jié)果表明，遷移時(shí)間隨著pH的增加而減少，但pH值小于或大于5.0時(shí)，都有部分酸分不開(kāi)，當(dāng)pH等于5.0時(shí)，各酸的分離效果均較好。

圖2 pH值對(duì)有機(jī)酸遷移時(shí)間的影響Fig.2 Effect of pH on the migration times of the organic acids

2.1.3 緩沖溶液種類(lèi)和濃度對(duì)分離的影響

由于質(zhì)譜中必須使用易揮發(fā)的緩沖溶液，難揮發(fā)鹽的緩沖溶液（如磷酸鹽等）容易堵塞噴霧口、污染噴霧室、影響樣品的電離。因此本研究選擇了易揮發(fā)性的銨鹽，如甲酸銨和醋酸銨作為緩沖溶液，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)醋酸銨的分離效果比甲酸銨好。不同濃度的乙酸銨緩沖溶液對(duì)分離度的影響也不同，有機(jī)酸的遷移時(shí)間隨緩沖溶液濃度的增加而加長(zhǎng)，從而改善分離度。但是緩沖溶液濃度太大，會(huì)產(chǎn)生焦耳熱效應(yīng)，引起區(qū)帶增寬和分析時(shí)間延長(zhǎng)，同時(shí)各酸的電離強(qiáng)度也降低。綜上，緩沖溶液的濃度為40.0mmol／L時(shí)，樣品分離效果和電離強(qiáng)度較好。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)對(duì)比了全掃描模式（FS）和選擇離子掃描模式（SIM），發(fā)現(xiàn)FS模式下8種有機(jī)酸的靈敏度略好于SIM模式，靈敏度比對(duì)結(jié)果列于表1。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇FS模式。

鞘液是影響電噴霧電離條件的重要因素，選擇合適的鞘液有利于樣品離子化過(guò)程中液滴的去溶劑化，能夠促進(jìn)樣品電離，降低背景信號(hào)。對(duì)比了甲醇、異丙醇、乙腈對(duì)樣品電離的影響，結(jié)果顯示，使用異丙醇作為鞘液時(shí)，背景噪音低且樣品電離強(qiáng)度大，當(dāng)異丙醇濃度達(dá)30%時(shí)，響應(yīng)值最高。

表1 全掃描模式與選擇離子掃描模式的靈敏度對(duì)比（S／N＝3，mg／L）Table 1 Comparison of eight acids sensitivity by FS and SIM（S／N＝3，mg／L）

甲酸、乙酸、氨水是常用的鞘液添加劑，在30%異丙醇溶液中分別添加了甲酸、乙酸、氨水，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加氨水效果最佳。綜合考慮8種組分的檢測(cè)靈敏度，選擇3mmol／L氨水作為鞘液添加劑，其濃度對(duì)電離的影響示于圖3。

2.3 鞘液的流速對(duì)樣品電離的影響

本研究考察了不同鞘液流速對(duì)樣品電離的影響。當(dāng)流速?gòu)?μL／min升到6μL／min時(shí)，樣品的電離強(qiáng)度隨著流速的增加而升高；當(dāng)流速大于8μL／min時(shí)，樣品的電離強(qiáng)度反而降低，因?yàn)榍室旱牧魉偬螅瑢?duì)樣品有稀釋作用。因此選擇鞘液的流速為6μL／min。

圖3 鞘液中氨水的濃度對(duì)電離的影響Fig.3 Effect of the concentration of the ammonium in sheath liquid on ionization

2.4 樣品的色譜圖及定性分析

在優(yōu)化的條件下，8種組分在15min內(nèi)獲得分離度較好的總離子流色譜圖，示于圖4。根據(jù)各組分的出峰時(shí)間和一級(jí)質(zhì)譜m／z值進(jìn)行定性分析。

2.5 線性關(guān)系及檢出限

配制一系列不同濃度的草酸、富馬酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸、抗壞血酸、酒石酸和乳酸標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，按最優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定。以8種有機(jī)酸的分子離子峰的峰面積對(duì)濃度（mg／L）進(jìn)行線性回歸，以峰面積外標(biāo)法定量，得到分析物回歸方程及相關(guān)系數(shù)，以S／N＝3為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)得各物質(zhì)的檢出限，列于表2。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)品（a）和樣品（b）的總離子流圖Fig.4 Total ion chromatogram of standard mixture（a）and samples（b）

2.6 精密度和回收率實(shí)驗(yàn)

將同一樣品分別取2份，其中一份作為本底，另一份準(zhǔn)確加入一定量8種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3的方法處理成待測(cè)溶液，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)每份樣品平行測(cè)定5次，按照外標(biāo)法定量并計(jì)算其回收率，結(jié)果列于表3。

2.7 樣品分析

按優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)市售的5種葡萄酒的有機(jī)酸進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果列于表4。

表2 8種有機(jī)酸的線性關(guān)系和檢出限Table 2 The linear range and detection limit of eight organic acids

表3 樣品加標(biāo)回收率（n＝5）Table 3 Recovery of the method（n＝5）

表4 樣品測(cè)定結(jié)果（n＝5）Table 4 Results of sample analysis（n＝5）

3 結(jié)論

本研究采用毛細(xì)管電泳－電噴霧電離質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定了葡萄酒中草酸、富馬酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸、抗壞血酸、酒石酸和乳酸8種有機(jī)酸含量，該方法不需衍生，前處理簡(jiǎn)單、快速、專(zhuān)一性強(qiáng)，靈敏度、重現(xiàn)性好，適合復(fù)雜體系中有機(jī)酸成分的分析。

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