邊盼盼 徐百成 馬建鸝 楊小龍 李倩 劉曉雯 縱亮 朱一鳴 韓冰 郭玉芬

·臨床研究·

甘肅省特有少數(shù)民族耳聾人群中GJB2基因突變分析*

邊盼盼1徐百成1馬建鸝1楊小龍1李倩2劉曉雯1縱亮2朱一鳴1韓冰2郭玉芬1

目的探討GJB2基因突變在甘肅省特有少數(shù)民族耳聾人群中的分布，并分析其民族特異性。方法

在簽署知情同意書的前提下，采集甘肅省特有的東鄉(xiāng)族、保安族及裕固族中184例重度至極重度感音神經(jīng)性聾患者的外周靜脈血，提取DNA，針對GJB2基因的編碼區(qū)行PCR擴(kuò)增及DNA序列測定，分析GJB2基因突變在這三個民族耳聾患者中的分布，并與已經(jīng)完成的本地區(qū)464例漢族感音神經(jīng)性聾患者的相應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。結(jié)果GJB2基因在東鄉(xiāng)族155例、裕固族12例、保安族17例和漢族464例耳聾患者中的致病等位基因頻率分別為9.03%（28／310）、12.5%（3／24）、5.88%（2／34）、12.17%（113／928），三個特有少數(shù)民族與漢族均無統(tǒng)計學(xué)差異。c.235delC和c.299_300del AT是東鄉(xiāng)族的熱點突變，等位基因頻率均為3.87%（12／310），在所有致病等位基因中占85.71%（24／28）。裕固族c.35del G的等位基因頻率最高，為8.33%（2／24），漢族中c.235delC是熱點突變，等位基因頻率為10.35%（96／928），東鄉(xiāng)族c.299_300del AT和裕固族c.35delG的等位基因頻率［分別為30.87%（12／310）、8.33%（2／310］均高于漢族［分別為0.43%（4／928）、0.54%（5／928）］。結(jié)論 在甘肅省特有的東鄉(xiāng)族、保安族和裕固族非綜合征型聾患者中GJB2基因突變具有相似的分布且與漢族類似；東鄉(xiāng)族與裕固族GJB2基因的熱點突變與漢族不同。

耳聾； GJB2； 少數(shù)民族； 突變

目前研究發(fā)現(xiàn)，GJB2基因突變是遺傳性非綜合征型聾主要的分子病因之一［1，2］，其在非綜合征型聾患者中的突變形式就有109種（http：／／davinci. crg.es／deafness／index.php？seccion＝mut_db＆db＝nonsynd＆nonsynd＝cx26mut，截止至2012-11 -1），其中顯性突變9種，隱性突變90種，性質(zhì)不明的突變10種。針對不同種族和民族耳聾人群的研究發(fā)現(xiàn)，GJB2基因突變頻率和熱點突變均存在較大的差異［3～6］。GJB2基因突變在漢族耳聾人群的致病等位基因頻率較高［7，8］。

從民族起源來講，甘肅省獨有的東鄉(xiāng)族、裕固族、保安族均具有自己獨特的種族背景，本研究對這三個民族的耳聾人群進(jìn)行GJB2基因分子流行病學(xué)調(diào)查分析，旨在了解甘肅省特有這三個少數(shù)民族耳聾人群中GJB2基因的突變頻率、熱點突變及其民族特異性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取甘肅省東鄉(xiāng)族、保安族和裕固族聚居的臨夏回族自治州各縣、張掖市肅南裕固族自治縣及甘肅省各特教學(xué)校的155例東鄉(xiāng)族、17例保安族、12例裕固族和464例漢族的非綜合征型聾患者為研究對象，所有患者均來自不同家庭并排除外、中耳病變所致的聽力下降。東鄉(xiāng)族患者中男98例，女57例，年齡3個月～76歲，平均28.27±18.5歲；裕固族患者中男8例，女4例，年齡4～63歲，平均31.14±21.64歲；保安族患者中男11例，女6例，年齡8～67歲，平均40.29±14.91歲；漢族患者男262例，女202例，年齡6～39歲，平均15±3.58歲。按照聽力損失的國際標(biāo)準(zhǔn)分級（WHO1997）：東鄉(xiāng)族患者中重度聽力損失9例，重度9例，極重度137例；裕固族患者中重度聽力損失2例，重度2例，極重度8例；保安族患者中重度聽力損失1例，重度2例，極重度14例；漢族患者中度聽力損失1例，中重度1例，重度50例，極重度412例。

1.2 研究方法

1.2.1 病史采集 采用一對一問答方式詢問家屬并對患者進(jìn)行全身體格檢查及耳鼻咽喉?？茩z查后填寫調(diào)查問卷［9］，問卷內(nèi)容包括一般情況、耳聾發(fā)病史、耳部外傷史、藥物史、新生兒期高危因素、全身其他系統(tǒng)情況（心臟病、骨骼發(fā)育、視力）、智力發(fā)育情況、母親分娩史、家族史、其他遺傳疾病史、外耳和中耳疾病史和聽力學(xué)檢查資料，并對懷疑有遺傳性聾的患者繪制家系圖譜。

1.2.2 聽力檢查 對大齡及成年耳聾患者運用Madsen純音聽力計行純音聽閾檢查，對所有患者用美國智聽公司Smart EP聽覺誘發(fā)電位儀行聽性腦干反應(yīng)測試，同時行聲導(dǎo)抗檢查以排除中耳病變。

1.2.3 血樣采集及DNA提取 在與患者家屬簽訂知情同意書的前提下抽取每位患者外周靜脈血約5 ml，混合2 ml ACD-EDTA抗凝劑靜置凍存，4℃運送，期間避免震蕩、溶血，保存于-20℃冰箱。用鹽析法提取外周血白細(xì)胞DNA，TE溶解后用1%的瓊脂糖凝膠電泳定性，并用Thermo Nanodrop 2000分光光度計進(jìn)行DNA濃度和純度的檢測。配制濃度約為50 ng／μl的工作液保存于4℃?zhèn)溆?，母液置?20℃長期保存。

1.2.4 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測序 用配制的工作液進(jìn)行GJB2編碼序列的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段長度為970 bp，1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后使用ABI3737XL測序儀進(jìn)行擴(kuò)增片段的DNA測序。使用DNAstar7.0軟件進(jìn)行GJB2基因突變位點的判讀，總結(jié)分析各民族的致病等位基因頻率。致病等位基因頻率＝致病等位基因數(shù)／等位基因總數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 各民族間的致病等位基因頻率運用SPSS 17.0軟件采用兩兩比較的辦法，進(jìn)行卡方檢驗，ɑ＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 東鄉(xiāng)族耳聾患者GJB2基因突變的檢測結(jié)果

155例耳聾患者中，12例明確為GJB2基因突變所致（9例純合，3例復(fù)合雜合），4例為雜合突變，74例為其他已明確的多態(tài)或其他序列改變，65例無突變（表1）。東鄉(xiāng)族共檢測到5種已知致病突變形式，等位基因頻率為9.03%（28／310），其中c.299_ 300del AT和c.235delC的等位基因頻率最高，均為3.87%（12／310），占所有致病等位基因數(shù)的85.71%（24／28），是東鄉(xiāng)族耳聾患者GJB2基因的熱點突變（表2）。東鄉(xiāng)族中c.299_300del AT的致病頻率高于c.235del C，占所有致病突變的58.33%（7／12）（表1）。

表1 GJB2致病基因型在各民族的分布（例）

表2 GJB2基因突變等位基因頻數(shù)在不同民族的分布（例）

2.2 裕固族耳聾患者GJB2基因突變的檢測結(jié)果

12例耳聾患者中，1例明確為GJB2基因突變所致，基因型為235delC／35delG（表1）；1例為c.35delG雜合突變，6例為其他已明確的多態(tài)，4例無突變。致病等位基因頻率為12.50%（3／24），其中c.35delG的等位基因頻率為8.33%（2／24），占所有致病突變的66.7%（2／3）；占所有致病突變的66.67%（2／3）（表2）。

2.3 保安族耳聾患者GJB2基因突變的檢測結(jié)果

在保安族17例耳聾患者中僅發(fā)現(xiàn)1例176_ 191del16／299_300del AT的復(fù)合雜合突變（表1），致病等位基因頻率為5.88%（2／34）。

2.4 漢族耳聾患者GJB2基因突變的檢測結(jié)果

464例耳聾患者中，37例明確為GJB2基因突變所致（均為純合突變），39例為雜合突變，235例為其他已明確的多態(tài)或其他序列改變，153例無突變（表1）。致病等位基因頻率為12.17%（113／928），其中c.235delC的突變頻率最高，為10.35%（96／928）（表2）。

經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，東鄉(xiāng)族、裕固族、保安族耳聾患者GJB2致病等位基因頻率與漢族比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P值分別為0.131、0.962、0.267，均為P＞0.05），東鄉(xiāng)族c.299_300del AT等位基因頻率顯著高于漢族（P＜0.01）；東鄉(xiāng)族c.235del C等位基因頻率明顯低于漢族（P＜0.01）；裕固族c.35delG的等位基因頻率（8.33%，2／24）顯著高于漢族（0.54%， 5／928）（P＜0.01）。

3 討論

東鄉(xiāng)族、保安族和裕固族是甘肅省特有少數(shù)民族，人口較少，相對聚居。民族信仰、經(jīng)濟(jì)模式和居住環(huán)境的特殊性決定了這些民族多為族內(nèi)通婚，遺傳信息的保守性較好。從文中結(jié)果看，東鄉(xiāng)族、保安族和裕固族的GJB2致病等位基因頻率分別為9.03%、5.88%和12.50%，且三個民族之間以及各民族與漢族之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，說明GJB2基因突變在甘肅省特有少數(shù)民族的耳聾病因中占有重要地位。

很多研究結(jié)果提示GJB2基因突變頻率及熱點突變具有種族特異性和民族特異性。伊朗南部高加索人種GJB2基因的突變頻率為15%，c.35delG是其主要突變形式［3］；德系猶太人c.167del T高發(fā)［4］；非洲尼格羅人種c.427C＞T的等位基因頻率較高［5］；中國西北地區(qū)（蒙古人種）針對多民族的研究中GJB2致病等位基因頻率為14.2%，c.235delC是其主要突變形式，等位基因突變頻率為9.8%［6］；韓國朝鮮族和日本大和民族c.235delC的等位基因突變頻率分別為9.3%和3.9%［10］。

本組對象中，東鄉(xiāng)族非綜合征型聾患者的GJB2基因的主要突變形式與漢族類似，均為c.299_ 300del AT和c.235delC，但c.299_300del AT等位基因頻率高于漢族（P＜0.01），c.235delC等位基因頻率卻低于漢族（P＜0.01）且東鄉(xiāng)族中c.299_ 300del AT的突變頻率高于c.235delC，占所有突變的58.33%（7／12），可見，c.299_300del AT是東鄉(xiāng)族GJB2基因最主要的突變形式。

追溯東鄉(xiāng)族的起源，在蒙古人說、混合說和回回色目人說即撒爾塔人說三種學(xué)說中，為學(xué)術(shù)界和東鄉(xiāng)族本民族認(rèn)可的是撒爾塔人為主說［11］。撒爾塔人即是以突厥人為主，并融合了蒙古等其他少數(shù)民族，突厥人屬于黃白混血人種，即蒙古利亞人與高加索人的融合，因此東鄉(xiāng)族的遺傳信息應(yīng)該繼承了蒙古利亞人和高加索人的特點。蒙古利亞人的熱點突變是c.235delC（占絕對優(yōu)勢）和c.299_ 300del AT［8］，高加索人的熱點突變是c.35delG［12］，所以民族起源并不能完全解釋c.299_300del AT在東鄉(xiāng)族非綜合征型聾患者中突變率如此高的現(xiàn)象。研究顯示［13］，c.71G＞A是印度人群中GJB2基因的主要突變形式，占所有突變形式的95%，未見高加索人種的c.35delG和c.167del T熱點突變。但印度人是雅利安人，屬于高加索人種，說明不同地域同一人種的突變形式可能存在差異。從遺傳學(xué)原理來講，疾病的表型除了與基因突變有關(guān)外，還同基因與環(huán)境等外在因素的相互作用有關(guān)。由此推論東鄉(xiāng)族非綜合征型聾患者GJB2基因的熱點突變是人種、地域環(huán)境差異以及種族遷徙演變等多種原因作用的結(jié)果，但仍需進(jìn)一步研究。

2003年Rothrock等［14］利用微衛(wèi)星標(biāo)記、PCR等方法對來自意大利、巴西、北美具有c.35delG突變的人群進(jìn)行SNP基因型分析，發(fā)現(xiàn)了一些相同且比較罕見的與c.35delG相關(guān)的SNP改變，為c.35delG突變的連鎖不平衡提供了證據(jù)，也為c.35delG突變在高加索人種中高發(fā)的原因是始祖效應(yīng)這一論點提供了證據(jù)。此外Van Laer等［15］的研究也支持上一觀點。c.35del G是法國、希臘、伊朗等高加索人種的熱點突變，在中國、日本等蒙古利亞人種的突變率普遍較低［11］，而本研究結(jié)果顯示裕固族耳聾患者中c.35del G占所有致病突變的66.67%（2／3），是熱點突變。裕固族起源于古代回鶻（回紇，Uyghur），具有明顯的高加索種族背景［16］，以往對于同是回鶻起源的維吾爾族人的研究中c.35delG的突變頻率也明顯高于漢族［8］。可見，GJB2基因的熱點突變c.35delG是始祖效應(yīng)在具有高加索種族背景的裕固族中的典型表現(xiàn)。

本研究中保安族共檢測到兩個致病等位基因，分別為c.299_300del AT和c.176_191del16，并不能得出有關(guān)熱點突變的明確結(jié)論，這與本民族人口基數(shù)少、耳聾人群少有關(guān)。

根據(jù)以上研究可知在東鄉(xiāng)族、保安族和裕固族非綜合征型聾人群中GJB2基因致病分布情況與漢族無差異。但東鄉(xiāng)族和裕固族的熱點突變情況卻不同于漢族。東鄉(xiāng)族的熱點突變是c.299_300del AT和c.235delC，兩者具有相同等位基因頻率；裕固族中c.35delG是熱點突變。說明GJB2基因突變在甘肅省特有少數(shù)民族非綜合征型聾人群中的致病情況具有民族特異性。

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（2012-12-20收稿）

（本文編輯 雷培香）

A Study of GJB2 Gene Mutation in Deaf People From Sole Minority Nationalities ln Gansu Province

Bian Panpan，Xu Baicheng，Ma Jianli，Yang Xiaolong，Li Qian，Liu Xiaowen，Zong Liang，Zhu Yiming，Han Bing，Guo Yufen
（Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery，the Second Hospital of Lanzhou University，Lanzhou，730030，China）

Objective To understand the prevalence of GJB2 gene mutation and to analyze the specificity of deaf people from sole minority nationalities in Gansu province.Methods Peripheral blood samples were obtained from people with moderately severe to profound sensorineural hearing loss（NSHL）in Dongxiang，Yugur and Bonan aren in Gansu province to extract genomic DNA.The codings of GJB2 gene were analyzed by PCR and direct sequencing，and compared with the data of 464 patients with SNHL from ethnic Han in Gansu.Results GJB2 gene Plutation was detated in 155 cases in 9.03%（28／310）Dongxiang，12 cases in 12.5%（3／24）Yugur，17 cases in 5. 88%（2／34）Bonan and 464 cases in 12.17%（113／928）Han，respectively.There was no difference of among each sole minority nationality and ethnic Han.The allele frequency of c.235delC and c.299_300del AT which were the main mutations while，ethnic Dongxiang，were both 3.87%（12／310），accounted for 85.7%in all pathogenic mutated alleles.c.35delG was the highest allele frequency which was 8.33%（2／24）in ethnic Yugur，and c.235delC wasthe most common mutation in ethnic Han with，the allele frequency of 10.35%（96／928），which was it is higher than those the allele frequencis of c.299_300del AT in ethnic Dongxiang and c.35del G in ethnic Yugur.Conclusion The prevalence of GJB2 gene mutation in sole minority nationalities in Gansu province is similor with that of in ethnic Han.National specificity exists between ethnic Dongxiang，Yugur and Han in mutation hotspots of GJB2 gene.

Deafness； GJB2； Minority nationalilies

10.3969／j.issn.1006-7299.2013.04.002

時間：2013-5-9 13：58

R764.43

A

1006-7299（2013）04-0331-04

* 國家自然科學(xué)基金（81172765，30771857）、國家自然基金重大國際合作項目（81120108009）、全軍“十二五”重點項目（BWS11J026）聯(lián)合資助

1 蘭州大學(xué)第二醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科（蘭州 730030）； 2 解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科、解放軍耳鼻咽喉研究所

邊盼盼，女，內(nèi)蒙古人，碩士，主要從事耳聾防治研究。

郭玉芬（Email：gyflhmm＠yahoo.cn）

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20130509.1358.002.html