張佳偉 黃建釗 趙鵬偉 劉江偉

貴州省人民醫(yī)院肝膽外科，貴州 貴陽 550002

冬蟲夏草在大鼠離體肝臟保存中的實(shí)驗(yàn)研究

張佳偉 黃建釗 趙鵬偉 劉江偉

貴州省人民醫(yī)院肝膽外科，貴州 貴陽 550002

目的：研究冬蟲夏草對離體大鼠肝臟低溫保存損傷的保護(hù)作用。方法：采用大鼠肝臟離體非循環(huán)灌注模型（IPRL），在乳酸林格氏液（LR液）中加入不同劑量冬蟲夏草對離體大鼠肝臟保存12h，記錄膽汁流出量，測定灌注流出液AST、ALT、LDH和氧自由基代謝產(chǎn)物丙二醛（MDA）的含量，觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果：冬蟲夏草組（900mg·L－1）的膽汁分泌（172.95±12.7）μl明顯高于保存對照組（98.68±5.5）μl（P＜0.01），冬蟲夏草組（900mg·L－1）灌出液中丙二醛（7.68±0.647）nmol·mL－1、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）（41.53±11.6）U·L－1、門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）（38.87±12.66）U·L－1及乳酸脫氫酶（LDH）（191±21.8）U·L－1明顯低于保存對照組（9.49±0.65）nmol·mL－1、（236.12±94.5）U·L－1、（145.12±81.56）U·L－1及（540.37±176.9）U·L－1，有顯著性差異（P＜0.01）。結(jié)論：冬蟲夏草可明顯的提高大鼠離體肝臟的保存效果，作用機(jī)理與提高肝細(xì)胞抗氧自由基能力、維持細(xì)胞膜功能、減少線粒體損傷、改善肝臟微循環(huán)的作用有關(guān)。

器官保存；冬蟲夏草；大鼠；再灌注損傷

我們采用大鼠肝臟離體非循環(huán)灌注模型，觀察乳酸林格氏液（LR液）中加入不同劑量冬蟲夏草后保存大鼠肝臟的效果，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 采用健康、成年、清潔級SD大鼠（編號：scxk（黔）2002－0001）48只，體重350～400g，雌雄不限，購于貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2 動物分組 根據(jù)保存時(shí)間及LR液內(nèi)蟲草劑量的不同，把SD大鼠隨機(jī)分為6組，每組8只，保存溫度為2～4℃。非保存組（不含蟲草，保存時(shí)間0h）；保存對照組（不含蟲草，保存時(shí)間12h）；A組（含300mg·L－1蟲草，保存時(shí)間12h）；B組（含600mg·L－1蟲草，保存時(shí)間12h）；C組（含900mg·L－1蟲草，保存時(shí)間12h）；D組（含1200mg· L－1蟲草，保存時(shí)間12h）。

1.3 動物模型 大鼠非循環(huán)離體灌注模型的制備［1］：大鼠禁食12h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，仰臥固定。取腹部“十”字切口進(jìn)腹。經(jīng)下腔靜脈注入25U·mL－1肝素生理鹽水2mL。解剖肝門部，游離門靜脈、胰膽管。距肝門1cm處分別置管、固定。在右腎平面上切斷肝下下腔靜脈，經(jīng)門靜脈管以5mL·min－1原位灌注4℃的LR液30min，肝臟變?yōu)橥咙S色后連同部分膈肌切取，置于2～4℃保存液中保存12h。各組保存結(jié)束后，再經(jīng)門靜脈管以15m L·min－1恒溫37℃灌注LR液30min，灌注中持續(xù)通入95%O2與5% CO2混合氣體及20μmol·L－1牛磺膽酸鈉（非保存組不保存，肝臟切取后直接灌注）。

1.4 檢測指標(biāo)及方法 ①膽汁分泌量的測定：灌注中通過胰膽管采集離體肝臟分泌的膽汁。②流出液AST、ALT及LDH的測定：離體灌注最后2min，取灌注流出液2mL。用全自動生化分析儀測定AST、ALT及LDH的值。③流出液MDA的測定：離體灌注最后2min，取灌注流出液5mL，以3000r／min離心5min，取上清液，置于－40℃低溫冰箱保存待測。用ELISA法測定MDA含量。④肝臟病理組織損傷程度的比較：取肝中葉組織約1.0cm×0.5cm×0.5cm于10%中性甲醛溶液中固定，經(jīng)H－E染色，在放大100倍光鏡下采觀察肝細(xì)胞水變性、肝細(xì)胞氣球樣變性、肝細(xì)胞脂肪變性、肝細(xì)胞嗜酸變性、肝細(xì)胞嗜酸性壞死、肝細(xì)胞液化壞死、肝淤血、炎細(xì)胞浸潤。無該病變0分，出現(xiàn)該病變至占組織塊30%以下1分，占組織塊30%～50%2分，占組織塊50%以上3分。大鼠肝臟的損傷度通過評分方式來表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析，P＜0.05有差異，P＜0.01有極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠膽汁分泌量、灌出液丙二醛（MDA）含量及肝臟HE染色病理損傷評分見表1

表1 各組大鼠膽汁分泌量、灌出液丙二醛（MDA）含量及肝臟HE染色病理損傷評分的比較（±s）

表1 各組大鼠膽汁分泌量、灌出液丙二醛（MDA）含量及肝臟HE染色病理損傷評分的比較（±s）

說明：＃：與非保存組比較P＜0.05；＃＃：與非保存組比較P＜0.01。*：與保存對照組比較P＜0.05；**：與保存對照組比較P＜0.01。Δ：與A組比較P＜0.05；ΔΔ：與A組比較P＜0.01；Ο：與B組比較P＜0.05；ΟΟ：與B組比較P＜0.01；◎：與C組比較P＜0.05；◎◎：與C組比較P＜0.01，無圖標(biāo)表示無差異。

實(shí)驗(yàn)動物分組非保存組（n＝8）保存對照組（n＝8）A組（n＝8）B組（n＝8）C組（n＝8）D組（n＝8）汁分泌量（μl）223.05± 17.7**ΔΔΟΟ◎◎98.68±5.552＃＃ΔΔΟΟ◎◎157.12±12.39＃＃**◎152.38±9.37＃＃**◎◎172.95±12.7＃＃**ΔΟΟ156.5±12.39＃＃**◎灌出液MDA含量（nmol·m l－1）5.73±0.854**ΔΔΟΟ◎◎9.49±0.651＃＃**ΔΔΟΟ◎◎8.44±0.38＃＃**◎8.38±0.539＃＃**◎7.68±0.647＃＃**ΔΟ7.18±0.84＃＃**ΔΔΟΟ肝臟損傷度評分0.25±0.46**ΔΔΟΟ◎◎6.5±1.41＃＃ΔΟΟ◎◎4.875±1.45＃＃*4.5±1.6＃＃**4.62±1.5＃＃**4.75±1.0＃＃*

2.2 各組灌注流出液AST、ALT及LDH測定見表2

表2 為各組大鼠灌出液ALT、AST、LDH的比較（±s）

表2 為各組大鼠灌出液ALT、AST、LDH的比較（±s）

說明：＃：與非保存組比較P＜0.05；＃＃：與非保存組比較P＜0.01。*：與保存對照組比較P＜0.05；**：與保存對照組比較P＜0.01。Δ：與A組比較P＜0.05；ΔΔ：與A組比較P＜0.01；Ο：與B組比較P＜0.05；ΟΟ：與B組比較P＜0.01；◎：與C組比較P＜0.05；◎◎：與C組比較P＜0.01，無圖標(biāo)表示無差異。

實(shí)驗(yàn)動物分組非保存組（n＝8）保存對照組（n＝8）A組（n＝8）B組（n＝8）C組（n＝8）D組（n＝8）灌出液ALT（U·L－1）9.37±5.8**ΔΔΟΟ◎◎236.12±94.5＃＃ΔΔΟΟ◎◎77.73±22.9＃＃**◎◎69.37±20.2＃＃**◎◎41.53±11.6＃＃**ΔΔ○○73.25±19.2＃＃**◎◎灌出液AST（U·L－1）14.25±6.77**ΔΔΟΟ◎◎145.12±81.56＃＃ΔΔΟΟ◎◎55.75±14.29＃＃**◎59.75±23.51＃＃**◎38.87±12.66＃＃**ΔΟ57.1±14.4＃＃**◎灌出液LDH（U·L－1）30.25±27.4**ΔΔΟΟ◎◎540.37±176.9＃＃ΔΔΟ◎◎Ο297.25±71.5＃＃**◎◎282.875±39.4＃＃**◎◎191±21.8＃＃**ΔΔΟΟ201±27.1＃＃**ΔΔΟΟ◎◎

2.3 各組大鼠肝臟HE染色圖1－6

3 討論

冬蟲夏草是一種常用的藥用蟲生真菌，屬肉座菌目麥角菌科蟲草屬植物。其活性成分包括核苷類化合物、甾醇類、多糖類、超氧化物歧化酶（SOD）、多種氨基酸、多種維生素及礦物質(zhì)元素等。它不但具有增強(qiáng)免疫應(yīng)答、抑制腫瘤細(xì)胞生長、抗炎抗病毒、保護(hù)肝腎功能、改善心血管功能、預(yù)防高血糖等功效，還具有強(qiáng)大的抗氧自由基損害、保護(hù)細(xì)胞膜及線粒體損傷的功能［2－4］。

研究表明冬蟲夏草提高肝組織對抗脂質(zhì)過氧化，減輕細(xì)胞膜及線粒體的損傷與SOD、D－甘露醇及粘多糖的存在有密切關(guān)系。葉博［5］認(rèn)為SOD是體內(nèi)自由基清除系統(tǒng)內(nèi)一個(gè)重要抗過氧化酶，作用是催化超氧陰離子生成H2O2，從而阻斷毒性更強(qiáng)的羥自由基產(chǎn)生。又是超氧陰離子的底物誘導(dǎo)酶，保護(hù)細(xì)胞免遭有氧代謝物的損傷。在維護(hù)機(jī)體活性氧代謝的平衡中起重要作用。口如琴［6］發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草中含有SOD，活性高達(dá)340U／g干重，可顯著提高臟器中抗氧化酶活力，降低B型單胺氧化酶活力和減少M(fèi)DA含量。路海東等［7］通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)冬蟲夏草對組織中過氧化物脂質(zhì)的生成有明顯的對抗作用，具有良好的抗氧化作用。

D－甘露醇是HFR的特異性清除劑，而所含蟲草素對SAFR有清除作用，它們共同作用于機(jī)體產(chǎn)生的自由基，防止自由基對細(xì)胞膜的攻擊，保護(hù)膜功能的穩(wěn)定；冬蟲夏草中粘多糖與細(xì)胞相互作用，在膜表面形成了一層糖屏障，有效地防止機(jī)體缺氧時(shí)肝組織細(xì)胞膜脂質(zhì)流動性的降低，保護(hù)細(xì)胞膜上Na、K－ATP酶活性，維持細(xì)胞膜功能，從而防止細(xì)胞受到氧自由基的損傷［8］。張藿等［9］通過建立糖尿病模型，來闡明了冬蟲夏草對糖尿病小鼠肝線粒體氧化損傷的保護(hù)效應(yīng)。

關(guān)于肝移植保存－再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制，現(xiàn)尚未完全闡明，但其與氧自由基損傷、細(xì)胞膜及線粒體損傷密切相關(guān)。故我們探討具有抗氧自由基損傷、保護(hù)細(xì)胞膜及線粒體的中藥冬蟲夏草用于離體肝臟研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LR液中加入冬蟲夏草后的A、B、C、D組，膽汁的分泌量明顯高于保存對照組。冬蟲夏草濃度為0～900mg·L－1時(shí)，膽汁的分泌量與冬蟲夏草的劑量呈正相關(guān)。ALT、AST及LDH能反映肝細(xì)胞的損傷程度，間接反映肝臟再灌注的微循環(huán)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，含有冬蟲夏草的A、B、C、D組AST、ALT及LDH值均小于保存對照組，且冬蟲夏草濃度為900mg·L－1時(shí)降低最明顯。故我們認(rèn)為冬蟲夏草可維持細(xì)胞膜功能、降低大鼠肝細(xì)胞的損傷，并對肝臟的微循環(huán)及肝細(xì)胞膽汁分泌功能的保護(hù)是有效的。MDA為氧自由基的代謝產(chǎn)物，可直觀的反映肝臟抗氧自由基的能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肝臟保存12h后的保存對照組MDA含量明顯高于肝臟未保存組，而含冬蟲夏草的A、B、C、D組MDA含量則顯著低于保存對照組（P＜0.01），濃度為900mg·L－1與濃度為1200mg·L－1時(shí)降低最明顯，兩組之間無明顯差異。這與大鼠肝細(xì)胞損傷及膽汁分泌功能的變化是一致的。從肝臟H－E染色的病理損傷來看，含有冬蟲夏草的A、B、C、D組的損傷程度較保存對照組輕，且冬蟲夏草組內(nèi)各濃度無明顯差異。

因此，LR液中加入冬蟲夏草可明顯提高供體肝臟的保存效果。我們認(rèn)為，冬蟲夏草的作用機(jī)理是多方面的，但它提高供肝保存質(zhì)量的機(jī)理可能主要與提高肝細(xì)胞抗氧自由基能力，維持細(xì)胞膜功能，減少線粒體損傷，改善肝臟微循環(huán)的作用有關(guān)。

［1］李立，李春滿，等.自制KYL液和UW液保存大鼠肝臟效果的比較，［J］.中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志，2005，12（4）：375－379.

［2］顧宇翔，宋聿文，范立強(qiáng)，等.蟲草及其發(fā)酵制品抗氧化能力研究［J］.中國中藥雜志，2007，32（11）：1028－1031.

［3］張藿，陳順志，劉樹森.冬蟲夏草提取液對糖尿病小鼠肝線粒體氧化損傷的保護(hù)效應(yīng)［J］.中國臨床康復(fù)，2006，10（39）：132－134.

［4］張敏玲.冬蟲夏草對運(yùn)動小鼠肝組織自由基代謝及血清酶活性的影響［J］.西安體育學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，22（6）：70－72.

［5］葉博.北蟲草藥理作用研究，［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，15（9）：52－54.

［6］口如琴.蟲草真茵棒束孢霉的營養(yǎng)成分及其延緩衰老的作用，［J］.營養(yǎng)學(xué)報(bào)，1995，（4）：3415.

［7］路海東，王惠娟，侯大平.冬蟲夏草脂質(zhì)體口服液抗脂質(zhì)過氧化作用，［J］.黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2002，25（4）：42.

［8］張敏玲.冬蟲夏草對運(yùn)動小鼠肝組織自由基代謝及血清酶活性的影響［J］.西安體育學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，22（6）：70－72.

［9］張藿，陳順志，劉樹森.冬蟲夏草提取液對糖尿病小鼠肝線粒體氧化損傷的保護(hù)效應(yīng)［J］.中國臨床康復(fù)，2006，10（39）：132－134.

Effect of Cordyceps on preserved ex vivo rat liver

Objective：To study the protective effect of Cordyceps on cryopreservation injury of ex vivo rat liver。Methods：U-sing the non－circulated isolated perfusion of rat liver，the preservation effects o Lactate Ringer’s（LR）solution containing Cordycepswith differentdoseswere compared.After the rat liverswere preserved for12h in LRsolution with the addition of Cordyceps，measuring the bile production，the contents of AST、ALT、LDH and MDA in LR’s perfusate，observing themorphological changes in liver and for liver pathology injury score.Results：the Cordyceps group（900mg·L－1）bile secretion areas（172.95±12.7）μl were greater than the preserved control group（98.68±5.5）μl（P＜0.01），the Cordyceps group（900mg·L－1）the contents of MDA（7.68±0.647）nmol·mL－1、ALT（41.53±11.6）U·L－1、AST（38.87±12.66）U·L－1and LDH（191±21.8）U ·L－1in perfusate were lower than the preserved control group（9.49±0.65）nmol·mL－1、（236.12±94.5）U·L－1、（145.12 ±81.56）U·L－1and（540.37±176.9）U·L－1，have significant difference（P＜0.01）Conclusion：The Cordyceps solution is improved the effectof the rat liver preservation，mechanism of action：Improve the ability resist oxygen free of liver cells，preserve the function of cellmembrane，reducemitochondrial damage，improve livermicrocirculation effects.

Organ Preservation；Cordyceps sinensis；rat；reperfusion injury

R285.5

A

1007－8517（2013）02－0012－03

2012.11.25）

。貴州省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究專項(xiàng)（黔中醫(yī)藥發(fā)（2007）35號）。

張佳偉（1984－），男，山西省蒲縣人，遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)碩士，肝膽外科專業(yè)，住院醫(yī)師；趙鵬偉（1984－），男，山西省隰縣人，遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)碩士，肝膽外科專業(yè)，住院醫(yī)師。

黃建釗，教授，主任醫(yī)師，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院器官移植研究所博士后出站，碩士生導(dǎo)師，肝膽外科專業(yè)，科主任。