梁玉

【摘 要】當(dāng)前，細(xì)菌耐藥性問題日趨嚴(yán)重，給臨床治療帶來困難，對β-內(nèi)酰胺類抗生素而言，某些菌青霉素結(jié)合蛋白（PBPs）改變造成的耐藥性，是β-內(nèi)酰胺類抗生素的特點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】氘標(biāo)記 青霉素結(jié)合蛋白 聚丙烯酰胺凝膠電泳 熒光放射自顯影

【中圖分類號】R515【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A【文章編號】1672-5158（2013）02-0334-01

當(dāng)前，細(xì)菌耐藥性問題日趨嚴(yán)重，給臨床治療帶來困難，對β-內(nèi)酰胺類抗生素而言，某些菌青霉素結(jié)合蛋白（PBPs）改變造成的耐藥性，是β-內(nèi)酰胺類抗生素的特點(diǎn)。PBPs為細(xì)菌的胞漿膜上的一些膜蛋白，是參與細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖生物合成的霉。β-內(nèi)酰胺類抗生素正是通過與PBPS結(jié)合，抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成引起細(xì)菌細(xì)胞死亡從而發(fā)揮殺菌作用。PBPs的數(shù)目、位置、親和力的變化造成與PBPs類抗生素不易結(jié)合而產(chǎn)生耐藥性。人們常采用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影的方法研究PBPs圖譜，以便了解敏感菌和耐藥菌的區(qū)別。PBPs測定技術(shù)是研究β-內(nèi)酰胺類耐藥性的重要手段。一般放射自顯影法的穿透力弱，不能獲得PBPs圖譜。要獲得獲得PBPs圖譜需采用熒光閃爍劑增效的“熒光放射自顯影法”。國內(nèi)有關(guān)PBps測定技術(shù)報(bào)道甚少，以3H標(biāo)記者更少，本文介紹這一技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種肺炎鏈球菌31003，30301（北京藥品生物制品檢定所； Pen08.R6本室保存菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基C+Y培養(yǎng)基，參見文獻(xiàn)。

1.1.3 儀器及藥品

垂直板凝膠電泳槽（吳縣科研儀器廠）；NG-l型真空凝膠干燥器（太倉電視機(jī)廠）；TGLL-1a型臺式高速冷凍離心機(jī)（中科院上海生物化學(xué)研究所）；8438-超低溫冰箱（FormaSclentifi。美國）；電泳儀DY-1型（上海醫(yī)用分析儀器廠）；丙烯酰胺（Aerylamide，臨海止學(xué)廠產(chǎn)）；甲撐雙丙烯酰胺.（big；瑞士產(chǎn)品）；N，N，N，N一四甲基乙二胺（TEMED，上海前進(jìn)農(nóng)場制劑廠）；3H標(biāo)記青霉素乙酰呱陡鹽（NewEngiandNuclear，美國）；x光底片（天津感光材料廠；KodakDiangnostiefilmX-OmatAR13X18em）；2，5-二苯基嗯哇（PPO，閃爍純，上海試劑一廠）；月桂酰肌氨酸鈉（Sarkosyl，Sigma）；十二烷基硫酸鈉（SDs，上海新華化工廠）；二甲基亞礬（DMso，北京旭東化工廠）。

1.2 方法

1.2.1 肺炎鏈球菌PBPs樣品的制備：將肺炎鏈球菌接種c+Y培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)。次日移種新鮮培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2～3h至對數(shù)生長期。菌液分裝試管，每管lml，于冰浴中加入不同濃度的氖標(biāo)記青霉素，37℃保溫10min。在冰浴中加入5ml非標(biāo)記青霉素G鈉鹽20萬單位/ml， 5000轉(zhuǎn)/min冷凍離心，棄去上清，菌體沉淀用50ml磷酸緩沖液（PH6.8）做成菌懸液。然后加入5～10ml20%月桂酰肌氨酸鈉，37℃保溫10min使細(xì)胞溶解。煮沸3min，置室溫備用。

1.2.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳：采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法。凝膠薄片的制備（厚0.2cm），凝膠配方：分離膠（10%）：Aerylamide：bis（30：0.5）6.7ml，Tris（pH8.8，1.5ml/L）5ml，10%SDS 0.2ml，蒸餾水8.1ml，真空攪拌10～15min除去氣體，再加入TEMED。濃縮膠（5%）：按上述配方依次為1.7ml，2.5ml，0.1ml，5.6ml。先配制分離膠，灌注直立式電泳槽后，使凝膠凝固。次日加入濃縮凝膠，放入加樣梳，靜置2h。在加樣槽內(nèi)依次分別加入PBps樣品。接通電流，第一小時維持電壓在60V，至染料前沿到達(dá)分離膠和濃縮膠交界處，調(diào)高電壓至120V，走完全程約需3～4h，用考馬斯藍(lán)R250染色30～45min，過夜脫色。

1.2.3 熒光放射自顯影法：凝膠片用二甲基亞礬（DMSo）處理30min，再用新鮮DMSo再次處理30min，再用20%2，5-二苯基嗯哇處理2～3h，l%甘油和1%乙酸處理lh，將凝膠片貼附在厚濾紙上，使用凝膠真空干燥器進(jìn)行真空干燥。將凝膠片和x光底片貼緊，置于x光射線暗匣內(nèi)，置超低溫冰箱中-70℃使曝光1～2wr，將x光底片顯影，定影，沖洗得到PBPs的放射自顯影圖譜。x光底片預(yù)曝光條件：（1）國產(chǎn)x光底片用照相閃光燈紅色濾光片，加6層紅色玻璃紙濾過，x光底片上覆蓋6層紅色玻璃紙，距離50cm，閃光燈閃二次；（2）進(jìn)口x光底片預(yù)曝光用x光機(jī)最小功率100mA40kV，距離40cm，每張x光底片曝光0.04s。

1.2.4 競爭性結(jié)合試驗(yàn)：定量菌液中分別加入不同濃度的甲氧西林，37℃保溫10min，然后加入飽和量的3H標(biāo)記青霉素，37℃保溫10min，再按上述方法繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

本法測定肺炎鏈球菌全細(xì)胞中PBPs的含量，首先需要分離菌體蛋白，為使菌體蛋白濃度維持在一定的水平上，必須控制菌齡和菌液濃度。肺炎鏈球菌破碎細(xì)胞的方法以采用離子型去污劑sarkosyl為宜，它能選擇性地作用于胞漿膜，使胞漿膜破裂，菌體蛋白釋放出來，與此同時，已經(jīng)與青霉素結(jié)合的膜蛋白PBPs也一起釋放出來。樣品制備完畢，煮沸3min，以便除去某些蛋白質(zhì)的干擾，青霉素與PBPs結(jié)合較牢固，不會被破壞。

本實(shí)驗(yàn)采用SDS-PAGE方法（4-5），SDS在分離膠與濃縮膠中的終濃度均為0.1%。分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%。

3H標(biāo)記物穿透力較弱，用一般放射自顯影方法不能得出圖像，本實(shí)驗(yàn)采用熒光放射自顯影法（6-8）（Fluoro，aphy），檢測聚丙烯酰胺凝膠片上3H標(biāo)記的蛋白質(zhì)，有一定的優(yōu)點(diǎn)。PPO是熒光增效劑，其作用原理不是直接依賴3H放射出來的射線，而是藉助3H上的粒子與PPO相互作用發(fā)射出的光，造成x光底片的局部發(fā)黑得到深淺不同的暗線，從而獲得青霉素結(jié)合蛋白的圖譜。肺炎鏈球菌的PBPs圖譜上可見有三條區(qū)帶，即PBP1 （a、b）， PBP2和PBP3。一般情況下，青霉素濃度越大，親和力越強(qiáng)，顏色越深，在競爭性試驗(yàn)中，甲氧西林濃度越大，親和力越強(qiáng)，顏色越淺。

據(jù)報(bào)道（7-9），x光底片預(yù)曝光可增加熒光放射自顯影法的靈敏度，因?yàn)轭A(yù)曝光可以糾正樣品放射性和x光底片圖像吸收值之間的非線性關(guān)系。所以，經(jīng)預(yù)曝光的x光底片上所得到的圖像可以正確反映出樣品的放射性分布情況。

用國產(chǎn)x光底片不經(jīng)預(yù)曝光時，無圖像出現(xiàn)，經(jīng)預(yù)曝光則有圖像出現(xiàn)，用進(jìn)口x光底片未經(jīng)預(yù)曝光者，圖像的暗線區(qū)別不大。預(yù)曝光后的x光底片顯示出暗線深淺不同的正確圖像。國產(chǎn)x光底片與進(jìn)口x光底片比較，國產(chǎn)片敏感性較低，預(yù)曝光后的x光底片上出現(xiàn)的暗線普遍較淺且細(xì)，PBP1不可見。

參考文獻(xiàn)

[1] 錢海倫.細(xì)菌對卜內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性的研究進(jìn)展.中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007；20（3）：188

[2] 錢海倫，李靜.肺炎球菌生長培養(yǎng)基和菌種保存方法的研究.徽生物學(xué)通報(bào)，2009；16（l）：15

[3] 王蘇生，舒群芳，周芬凝膠中同位素測定的快速熒光自顯影方法.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2006；6：66