張中卒黃路虞志明陳翔韓智敏楊東詹平曹凱

1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，江西 南昌 330006；

2.江西省婦幼保健院兒童保健科，江西 南昌 330006

RNA干擾細(xì)胞周期蛋白依賴激酶6基因?qū)τ任娜饬黾?xì)胞生物學(xué)行為的影響

張中卒1黃路2虞志明1陳翔1韓智敏1楊東1詹平1曹凱1

1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，江西 南昌 330006；

2.江西省婦幼保健院兒童保健科，江西 南昌 330006

背景與目的：細(xì)胞周期蛋白依賴激酶6(cyclin-dependent kinase 6，CDK6)是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，有實(shí)驗(yàn)報道其在尤文肉瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，但在尤文肉瘤細(xì)胞中的生物學(xué)功能及相關(guān)機(jī)理仍不十分清楚。本研究旨在通過研究小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)沉默CDK6基因表達(dá)，探討其對尤文肉瘤A673、SK-ES-1細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。方法：將化學(xué)合成的CDK6-siRNA轉(zhuǎn)染至A673及SK-ES-1細(xì)胞中，實(shí)時熒光定量PCR法檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中CDK6 mRNA的表達(dá)；蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞CDK6以及CDK6下游因子視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因(Rb)、磷酸化Rb(P-Rb)的蛋白表達(dá)；分別采用CCK-8法、流式細(xì)胞儀、Transwell腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖、周期、凋亡、遷移以及侵襲能力的變化。結(jié)果：實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示，CDK6-siRNA能夠明顯降低細(xì)胞CDK6的表達(dá)(P＜0.01)。抑制CDK6表達(dá)后細(xì)胞的增殖速度明顯減緩，細(xì)胞周期分布發(fā)生改變，G0/G1期細(xì)胞的比例上升，而S期細(xì)胞的比例下降，細(xì)胞的早期凋亡率明顯升高(P＜0.01)。各組細(xì)胞的遷移能力：untreated組、si-con組及si-CDK6組A673細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(516.00±58.59)個、(534.00±124.77)個、(192.33±68.92)個，SK-ES-1細(xì)胞的穿膜數(shù)分別為(371.33±29.67)個、(363.33±60.28)個、(200.00±20.00)個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；各組細(xì)胞的侵襲能力：untreated組、si-con組及si-CDK6組A673細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(251.00±42.93)個、(238.67±78.62)個、(94.67±23.03)個，SK-ES-1細(xì)胞的穿膜數(shù)分別為(310.00±35.36)個、(302.33±41.31)個、(105.00±54.08)個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。Western blot檢測結(jié)果顯示，CDK6-siRNA能夠明顯降低細(xì)胞CDK6以及下游因子P-Rb的表達(dá)(P＜0.01)，但細(xì)胞總Rb表達(dá)量無明顯變化。結(jié)論：針對CDK6基因的特異性小RNA干擾片段能夠下調(diào)CDK6基因及蛋白的表達(dá)，并抑制尤文肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，誘導(dǎo)其凋亡。

尤文肉瘤；RNA干擾；細(xì)胞周期蛋白依賴激酶6

尤文肉瘤(Ewing’s sarcoma)是常見的惡性骨腫瘤之一，好發(fā)于兒童及青少年四肢長骨的骨干。該病具有惡性程度高、病程短、轉(zhuǎn)移率高、復(fù)發(fā)快的特點(diǎn)，預(yù)后極差［1］。細(xì)胞周期蛋白依賴激酶6 (cyclin-dependent kinase 6，CDK6)是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，通過與細(xì)胞周期蛋白D (cyclin D，CCND)結(jié)合形成復(fù)合物，使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因(retinoblastoma gene，Rb)發(fā)生磷酸化而促使E2F復(fù)合物分離，驅(qū)動細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖，介導(dǎo)了細(xì)胞周期的調(diào)控［2］。Luce等［3］實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在尤文肉瘤細(xì)胞株中存在CDK4/6、Rb、E2F1的高表達(dá)，提示阻斷CDK6可能起到抗腫瘤的作用。本實(shí)驗(yàn)通過靶向RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)阻斷CDK6-pRb信號的激活，并探討CDK6-siRNA對尤文肉瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系

尤文肉瘤A673、SK-ES-1細(xì)胞均購自美國ATCC細(xì)胞庫。

1.1.2 主要試劑

新生胎牛血清購于PAA公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、McCoy 5A培養(yǎng)基、0.25%胰酶購自Invitrogen公司；DharmaFECT 1 transfection reagents轉(zhuǎn)染試劑、si-CDK6/si-control購自Thermo公司。細(xì)胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit，CCK-8)購自Dojindo公司；PE Annexin-Ⅴ凋亡檢測試劑盒1，Transwell小室(8.0 μm孔徑)以及Matrigel膠購自美國BD公司；CDK6、Rb及磷酸化Rb(P-Rb)的一抗購自Cell signal technology公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠、山羊抗兔HRP標(biāo)記的二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；X線片為柯達(dá)公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

A673及SK-ES-1細(xì)胞在含有10 %胎牛血清、10 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的培養(yǎng)基中(A673細(xì)胞使用RPMI-1640培養(yǎng)基；SKES-1細(xì)胞使用McCoy 5A培養(yǎng)基)，37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%及90%飽和濕度的條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d，以適合的密度傳代細(xì)胞，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將化學(xué)合成的CDK6 siRNA按照DharmaFECT 1 transfection reagents 轉(zhuǎn)染試劑說明書分別轉(zhuǎn)染至A673、SK-ES-1細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)分為3組：si-CDK6組(轉(zhuǎn)染si-CDK6)、sicon組(轉(zhuǎn)染si-CDK6-control)、untreated組(僅加入脂質(zhì)體)，轉(zhuǎn)染后6 h換新鮮完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn) 。

1.2.2 實(shí)時定量PCR檢測轉(zhuǎn)染前后CDK6表達(dá)量的變化

轉(zhuǎn)染換液后48 h，運(yùn)用TRIzol法分別提取3組細(xì)胞的總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板，應(yīng)用PRISM 7000型定量PCR儀(APPlied Biosystems)進(jìn)行定量PCR檢測，以GAPDH作為內(nèi)參。檢測引物設(shè)計如下：CDK6順義鏈5’-GGACTTTCTTCATTCACACCG-3’，C D K 6 反 義 鏈 5 ’- G A C C A C T G A G G T T A G G C C A - 3’ ，G A P D H 順義鏈5’-TCAACGACCACTT TGTCAAGCTCA-3’，G A P D H 反 義 鏈5 ’-GCTGGTGGTCCAGGGGTCTTACT-3’。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 變性30 s后95 ℃延伸 5 s ，60 ℃延伸20 s，共40個循環(huán)，PCR擴(kuò)增結(jié)束后繪制熔解曲線，對目的基因的表達(dá)采用 2-ΔΔCt法行相對定量分析。

1.2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性

轉(zhuǎn)染換液后16 h，0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，離心后重懸于新鮮完全培養(yǎng)基，鋪于96孔板中，0.8×103個/孔(100 μL/孔)，每個處理組設(shè)置5個復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后測定細(xì)胞活性(0 h)，然后每隔24 h采用CCK-8試劑盒檢測1次細(xì)胞活性。CCK-8試劑盒里的WST-8試劑與線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成橙黃色的晶體，細(xì)胞活性越強(qiáng)，顏色越深。在檢測前2 h在每孔加入10 μL CCK-8液，37 ℃溫育2 h后，用自動酶標(biāo)平板閱讀儀于450 nm波長處讀取吸光度(A)值，設(shè)定650 nm作為參比波比，并扣除參比A值。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化

轉(zhuǎn)染換液后16 h，更換為無血清培養(yǎng)基，將細(xì)胞饑餓24 h后加入完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)36 h后胰酶消化收集細(xì)胞，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2遍。再將細(xì)胞重懸于100 μL PBS中，緩慢加入到400 μL預(yù)冷的無水乙醇中，室溫固定1 h后離心去乙醇。PBS洗滌細(xì)胞2遍后再次重懸于100 μL PBS，加入50 μg/mL的PI和100 μg/mL的RNase A，4 ℃避光溫育30 min，補(bǔ)加400 μL PBS過濾后480 nm波長進(jìn)行流式周期檢測。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡變化

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h(3%血清培養(yǎng))，用不含EDTA的胰酶消化貼壁細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2遍。將5×105個細(xì)胞重懸于100 μL結(jié)合緩沖液中。加入5 μL PE標(biāo)記的 Annexin Ⅴ和5 μL 7-AAD染料，輕輕混勻后室溫避光反應(yīng)15 min。補(bǔ)加200μL結(jié)合緩沖液，1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.6 Transwell腫瘤遷移實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，將培養(yǎng)小室插入到24孔板中，取2×105個轉(zhuǎn)染后細(xì)胞重懸于200 μL無血清的培養(yǎng)基中，將細(xì)胞混合液緩慢加入到小室的上層；小室的下層中加入含20%的FBS培養(yǎng)基作為趨化因子，37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)24 h后，取出小室，吸出小室中培養(yǎng)基，小心擦去上層細(xì)胞，PBS洗2次，倒置晾干，甲醇室溫固定10 min，倒置晾干，0.1%結(jié)晶紫染色5 min, 清水輕輕浸洗數(shù)次，倒置晾干，刀片揭膜，中性樹膠封片。鏡下觀察，隨機(jī)計數(shù)6個視野，計算結(jié)晶紫染色細(xì)胞數(shù)，即為穿膜細(xì)胞。

1.2.7 體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力變化

將凍存于-20 ℃的Matrigel膠4 ℃過夜融化，用4 ℃預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel至1 mg/mL，冰上操作。將40 μL稀釋后的Matrigel膠包被小室多聚碳酸酯膜的上室面，37 ℃溫育4～5 h，膠凝固后備用；轉(zhuǎn)染換液后24 h，取4×105個細(xì)胞重懸于200 μL無血清的培養(yǎng)基中，將細(xì)胞混合液加入到Matrigel膠的上層；小室的下層中加入含20% FBS的培養(yǎng)基作為趨化因子。CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，取出小室，吸出小室中培養(yǎng)基，小心擦去上層細(xì)胞，PBS洗2次，倒置晾干，甲醇室溫固定10 min，倒置晾干，0.1%結(jié)晶紫染色5 min，用蒸餾水輕輕浸洗數(shù)次，倒置晾干，刀片揭膜，中性樹膠封片。顯微鏡下隨機(jī)計數(shù)6個視野穿膜細(xì)胞并進(jìn)行統(tǒng)計。

1.2.8 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測細(xì)胞中相關(guān)蛋白水平變化

提取各組細(xì)胞中的總蛋白并用BCA法測蛋白濃度，取30 μg蛋白行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，濕轉(zhuǎn)硝酸纖維膜 (PVDF膜)后5 %脫脂牛奶封閉1 h，分別與CDK6(1∶1 200)、Rb(1∶1 200)、P-Rb(1∶800)、GAPDH(1∶60 000)蛋白特異性一抗稀釋液4 ℃溫育過夜，采用TBST緩沖液漂洗5次，每次5 min，加入相應(yīng)濃度的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗稀釋液，室溫1 h，采用TBST緩沖液漂洗5次，每次5 min，用ECL化學(xué)發(fā)光劑反應(yīng)，暗室下顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有檢測方法均設(shè)3份平行試驗(yàn)，采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。數(shù)據(jù)以表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)分析，兩組以上數(shù)據(jù)比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CDK6在尤文肉瘤A673、SK-ES-1細(xì)胞中的表達(dá)

實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，si-CDK6組A673細(xì)胞中CDK6的mRNA表達(dá)水平與untreated組及si-con組相比，分別下降約93.4%(P＜0.001)和93.3%(P＜0.001)；SK-ES-1細(xì)胞中CDK6的mRNA表達(dá)水平較untreated組及si-con組下降約85.2%(P＜0.001)和84.6%(P＜0.001)，而si-con組和untreated組A673及SK-ES-1細(xì)胞的CDK6表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，表明轉(zhuǎn)染后，CDK6在兩組細(xì)胞中表達(dá)明顯受到抑制(圖1)。

2.3 si-CDK6抑制尤文肉瘤A673、SK-ES-1細(xì)胞增殖

本研究運(yùn)用CCK-8法，分別檢測了細(xì)胞0、24、48、72、96 h各組細(xì)胞的增殖活性，并繪制了細(xì)胞生長曲線。轉(zhuǎn)染24 h，3組A673與SK-ES-1細(xì)胞的增殖活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，而轉(zhuǎn)染48 h，si-CDK6組細(xì)胞增殖活性明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，untreated組和si-con組細(xì)胞增殖活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，圖2)。

2.3 低表達(dá)CDK6后尤文肉瘤A673、SKES-1細(xì)胞周期分布發(fā)生改變

圖 1 Real time-PCR檢測CDK6在尤文肉瘤A673、SK-ES-1細(xì)胞中的表達(dá)Fig. 1 The expressions of CDK6 in A673 and SK-ES-1 cells were detected by real time PCR

圖 2 CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染后A673以及SK-ES-1細(xì)胞的增殖活性Fig. 2 The cell proliferations of A673 and SK-ES-1 were detected by CCK-8 assay after transfection

流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，低表達(dá)CDK6后細(xì)胞的周期分布發(fā)生改變，si-CDK6組A673細(xì)胞中G0/G1期比例為(65.40±0.79)%，較untreated組(50.11±1.40)%和si-con組(51.31±1.46)%明顯升高(P＜0.001)，而S期細(xì)胞(27.48±0.96)%較untreated組(42.59±2.00)%和si-con組(39.86±2.10)%則明顯減少(P＜0.001)，untreated組與si-con組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。SK-ES-1細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似。表明si-CDK6能明顯抑制A673以及SKES-1細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，阻滯細(xì)胞的周期進(jìn)程(圖3)。

2.4 低表達(dá)CDK6后各組尤文肉瘤A673、SKES-1細(xì)胞凋亡率比較

si-CDK6組A673細(xì)胞凋亡率為(30.13±4.21)%，較untreated組(15.40±1.99)%和si-con組(16.17±2.12)%明顯升高(P＜0.01)，SK-ES-1細(xì)胞凋亡率為(41.60±3.77)%，也較untreated組(23.67±2.85)%和si-con組(24.93±2.77)%明顯升高(P＜0.01)。untreated組和si-con組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。表明si-CDK6能促進(jìn)尤文肉瘤A673、SK-ES-1細(xì)胞的凋亡(圖4)。

圖 3 流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后A673以及SK-ES-1細(xì)胞的周期變化Fig. 3 Cell cycle distributions of A673 and SK-ES-1 cells were detected by flow cytometry after transfection

2.5 si-CDK6抑制尤文肉瘤A673、SK-ES-1細(xì)胞的遷移

Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，si-CDK6組A673、SK-ES-1細(xì)胞穿膜數(shù)分別為(192.33±68.92)個和(200.00±20.00)個，較untreated組［(516.00±58.59)個、(371.33±29.67)個］和si-con組［(534.00±124.77)個、(363.33±60.28)個］明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖5)。而si-con組和untreated組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。表明si-CDK6能抑制尤文肉瘤A673、SK-ES-1細(xì)胞的遷移。

2.6 si-CDK6抑制尤文肉瘤A673、SK-ES-1細(xì)胞的侵襲

Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，si-CDK6組A673及SK-ES-1細(xì)胞穿膜數(shù)分別為(94.67±23.03)個和(105.00±54.08)個，較untreated組［(251.00±42.93)個、(310.00±35.36)個］和sicon組［(238.67±78.62)個、(302.33±41.31)個］明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖6)。而si-con組和untreated組組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。表明si-CDK6能抑制尤文肉瘤A673、SK-ES-1細(xì)胞的侵襲。

圖 4 流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后A673以及SK-ES-1細(xì)胞凋亡變化Fig. 4 The apoptosis rates of A673 and SK-ES-1 cells were detected by flow cytometry after tansfection

圖 5 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染后A673及SK-ES-1細(xì)胞遷移能力的變化Fig. 5 Transwell assays were performed to detect the migratory abilities of A673 and SK-ES-1 cells after transfection (×100 stained with crystal violet)

圖 6 Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染后A673及SK-ES-1細(xì)胞侵襲能力的變化Fig. 6 Matrigel invasion assays were performed to detect the invasive abilities of A673 and SK-ES-1 cells after transfection (×100 stained with crystal violet)

2.7 si-CDK6后CDK6、P-Rb、Rb蛋白的表達(dá)

Western blot檢測顯示，轉(zhuǎn)染si-CDK6后細(xì)胞中CDK6的蛋白表達(dá)水平下降，同時CDK6下游靶基因P-Rb的表達(dá)也下降，但是總Rb的蛋白水平無明顯變化(圖7)。

圖7 Western blot 檢測CDK6干擾后相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.7 Western blot assay was performed to detect the expression of relevant proteins after si-CDK6 transfection

3 討 論

細(xì)胞周期的紊亂是腫瘤發(fā)生的基本特性之一，其中發(fā)揮重要調(diào)控作用的就是細(xì)胞周期依賴蛋白激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)家族。CDKs是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，共由11個家族成員構(gòu)成，最主要的有CDK1、CDK2、CDK3、CDK4和CDK6［4］，這些蛋白激酶共同調(diào)節(jié)了細(xì)胞有序的周期活動。其中CDK4和CDK6在調(diào)控細(xì)胞向增殖和分化過程中發(fā)揮重要作用，CDK6與周期蛋白D(cyclin D，CCND)結(jié)合后，Rb被磷酸化。P-Rb作用于核內(nèi)E2F/DP復(fù)合物，使得E2F與DP失偶聯(lián)，脫離后的E2F作用于下游轉(zhuǎn)錄因子，促使細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化［5］。CDK6表達(dá)增加，P-Rb生成增多，將加速細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。目前，在多種腫瘤組織中均檢測到了CDK6的表達(dá)失衡，如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和淋巴系統(tǒng)的惡性腫瘤等［6-8］。最近實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CDK6除了磷酸化Rb外，還能磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor-kapaB，NF-κB)的536位絲氨酸(Ser)，降低其活性［9］。NF-κB是體內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄激活因子，能夠調(diào)控細(xì)胞多種生物學(xué)過程相關(guān)基因的表達(dá)，包括炎性反應(yīng)、免疫反應(yīng)以及腫瘤發(fā)生等［10］，表明CDK6在生物學(xué)進(jìn)程中可能發(fā)揮著更加重要的生物學(xué)作用。Luce等［3］實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在尤文肉瘤細(xì)胞株中存在CDK6、P-Rb和E2F的高表達(dá)，提示CDK6在尤文肉瘤中可能發(fā)揮重要的作用。

為研究CDK6基因在尤文肉瘤生物學(xué)過程中的可能作用，本實(shí)驗(yàn)將化學(xué)合成的CDK6 siRNA轉(zhuǎn)染至尤文肉瘤細(xì)胞株內(nèi)，經(jīng)RT-PCR及Westernblot技術(shù)驗(yàn)證，其能有效地阻斷細(xì)胞中CDK6基因表達(dá)。隨后對細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)行為的檢測，比較轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞生物學(xué)行為的變化。結(jié)果顯示，拮抗CDK6表達(dá)后，細(xì)胞的增殖活性明顯下降，細(xì)胞的周期分布發(fā)生改變，處于G1期細(xì)胞比例增加，而處于S期的細(xì)胞比例下降，細(xì)胞的凋亡比例增加。此外，體外侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)顯示，沉默CDK6基因表達(dá)可明顯降低尤文肉瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力。提示CDK6在尤文肉瘤中充當(dāng)癌基因的作用，拮抗CDK6有可能成為腫瘤診治的新靶點(diǎn)。

為了進(jìn)一步探討CDK6在細(xì)胞中可能的作用機(jī)制，我們檢測了CDK6下游因子Rb及P-Rb在細(xì)胞表達(dá)量的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，拮抗CDK6后細(xì)胞中P-Rb的表達(dá)量下降，但是總Rb無明顯變化。提示拮抗尤文肉瘤細(xì)胞中CDK6表達(dá)所導(dǎo)致的增殖活性下降可能與其抑制Rb磷酸化相關(guān)。另外，實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)拮抗CDK6后，細(xì)胞的侵襲及遷移能力均下降，這可能與CDK6能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的運(yùn)動相關(guān)，F(xiàn)ahraeus等［11］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞的伸展過程中，CDK6蛋白由胞漿向細(xì)胞胞膜邊緣沉積。Liu等［12］的研究證實(shí)，運(yùn)用藥物拮抗前列腺癌細(xì)胞中CDK6的表達(dá)，通過激活轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor，TGF)誘導(dǎo)細(xì)胞由上皮向間葉組織分化(epithelialmesenchymal transition，EMT)，這在腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用。但是其對尤文肉瘤細(xì)胞侵襲及遷移能力影響的具體作用機(jī)制還有待更深入的研究。

拮抗CDK6基因表達(dá)具有較強(qiáng)的抑癌作用。PD0332991是第一個進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)的CDK6抑制劑，其通過抑制CDK6對Rb的磷酸化作用，抑制腫瘤細(xì)胞的周期進(jìn)程，但是只能作用于Rb表達(dá)陽性的腫瘤細(xì)胞，對Rb表達(dá)缺失的細(xì)胞沒有影響［13］。同時臨床Ⅰ期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PD0332991在治療Rb穩(wěn)定表達(dá)的腫瘤患者中，25%的患者出現(xiàn)了劑量限制范圍內(nèi)的不良反應(yīng)［14］。所以尋找到一種特異性強(qiáng)，不良反應(yīng)小的拮抗CDK6的方式是腫瘤治療的新思路。RNA干擾(RNAi)作為成熟的基因研究技術(shù)，通過雙鏈RNA介導(dǎo)同源靶基因的特異性降解，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默［15］。該技術(shù)操作簡單，能夠高效、特異地抑制靶基因的表達(dá)，并且其干擾的效應(yīng)呈現(xiàn)明顯的劑量和時間依賴性，具有分子藥動學(xué)特點(diǎn)［16］。所以本研究使用CDK6-siRNA片段干擾細(xì)胞中CDK6基因表達(dá)，其靶向明確，并且不依賴于細(xì)胞中Rb基因的表達(dá)，有望成為新型的尤文肉瘤治療方式，但是其可能存在的不良反應(yīng)還需大量的動物和臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，運(yùn)用特異性的siRNA能夠有效地沉默CDK6基因的表達(dá)，為研究其功能提供一個理想的技術(shù)平臺；拮抗CDK6基因在尤文肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)能明顯抑制細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)G1期細(xì)胞停滯及凋亡，降低細(xì)胞的侵襲和遷移能力，為進(jìn)一步開展尤文肉瘤的基因治療提供了理論基礎(chǔ)。

［1］ POTRATZ J, DIRKSEN U, JURGENS H, et al. Ewing sarcoma: clinical state-of-the-art ［J］. Pediatr Hematol Oncol, 2012, 29(1): 1-11.

［2］ OSCAR M T, SILVIA M L, VICENTE N. Roscovitine is an effective inducer of apoptosis of Ewing's sarcoma family tumor cells in vitro and in vivo ［J］. Cancer Res, 2005, 65: 9320-9327.

［3］ LUCE D, CATHERINE D O, THOMAS M, et al. Analysis of the expression of cell cycle regulators in Ewing cell lines: EWS-FLI-1 modulates P57 KIP2 and c-Myc expression［J］. Oncogene, 2001, 20(25): 3258-3265.

［4］ PINES J. Cyclins and cyclin-dependent kinases: theme and variations ［J］. Adv Cancer Res, 1995, 66: 181-212.

［5］ LEONARD J P, LACASCE A S, SMITH M R, et al. Selective CDK4/6 inhibition with tumor responses by PD0332991 in patients with mantle cell lymphoma ［J］. Blood, 2012, 119(20): 4597-4607.

［6］ GROSSEL M J, HINDS P W. Beyond the cell cycle: a new role for Cdk6 in differentiation ［J］. J Cell Biochem, 2006, 97(3): 485-493.

［7］ WIEDEMEYER W R, DUNN I F, QUAYLE S N, et al. Pattern of retinoblastoma pathway inactivation dictates response to CDK4/6 inhibition in GBM ［J］. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010, 107(25): 11501-11506.

［8］ NAGEL S, LEICH E, QUENTMEIER H, et al. Amplification at 7q22 targets cyclin-dependent kinase 6 in T-cell lymphoma［J］. Leukemia, 2008, 22(2): 387-392.

［9］ BUSS H, HANDSCHICK K, JURRMANN N, et al. Cyclindependent kinase 6 phosphorylates NF-kappaB P65 at serine 536 and contributes to the regulation of inflammatory gene expression ［J］. PloS One, 2012, 7(12): e51847.

［10］ HAYDEN M S, GHOSH S. Shared principles in NF-kappaB signaling ［J］. Cell, 2008,132(3): 344-362.

［11］ FAHRAEUS R, LANE D P. The p16(INK4a) tumour suppressor protein inhibits alphavbeta3 integrin-mediated cell spreading on vitronectin by blocking PKC-dependent localization of alphavbeta3 to focal contacts ［J］. EMBO J, 1999, 18(8): 2106-2118.

［12］ LIU F, KORC M, et al. Cdk4/6 inhibition induces epithelialmesenchymal transition and enhances invasiveness in pancreatic cancer cells ［J］. Mol Cancer Ther, 2012, 11(10): 2138-2148.

［13］ FRY D W, HARVEY P J, KELLER P R, et al. Specific inhibition of cyclin-dependent kinase 4/6 by PD 0332991 and associated antitumor activity in human tumor xenografts ［J］. Mol Cancer Ther, 2004, 3(11): 1427-1438.

［14］ SCHWARTZ G K, LORUSSO P M, DICKSON M A, et al. PhaseⅠstudy of PD 0332991, a cyclin-dependent kinase inhibitor, administered in 3-week cycles (Schedule 2/1) ［J］. Brit J Cancer, 2011, 104(12): 1862-1868.

［15］ FIRE A, XU S, MONTGOMERY M K, et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in caenorhabditis elegans ［J］. Nature, 1998, 391(6669): 806-811.

［16］ BARBARA A K, KRITON K, MARTIN T, et al. Inhibition of telomerase activity in human cancer cells by RNA interference［J］. Mol Cancer Ther, 2003, 2(3): 209-216.

《中國癌癥雜志》2013年征訂啟事

《中國癌癥雜志》是由國家教育部主管、復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院主辦的全國性腫瘤學(xué)術(shù)期刊，讀者對象為從事腫瘤基礎(chǔ)、臨床防治研究的中高級工作者。主要報道內(nèi)容：國內(nèi)外研究前沿的快速報道、專家述評、腫瘤臨床研究、基礎(chǔ)研究、文獻(xiàn)綜述、學(xué)術(shù)討論、臨床病理討論、病例報道、講座和簡訊等?！吨袊┌Y雜志》已入選中文核心期刊、中國科技核心期刊及全國腫瘤類核心期刊，并為中國科技論文統(tǒng)計源期刊，先后被“中國期刊網(wǎng)”、“萬方數(shù)據(jù)——數(shù)字化期刊群”和“解放軍醫(yī)學(xué)圖書館數(shù)據(jù)庫（CMCC）”等收錄。

《中國癌癥雜志》為月刊，大16開，80頁銅版紙（隨文彩圖），每月30日出版，單價8元，全年96元。國際標(biāo)準(zhǔn)刊號1007-3639，國內(nèi)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)刊號CN31-1727/R，郵發(fā)代號4-575。

讀者可在當(dāng)?shù)剜]局訂閱，漏訂者可直接向本刊編輯部訂閱。

也歡迎廣大作者來稿。

主 編：沈鎮(zhèn)宙

主 任：秦 娟

聯(lián)系地址：上海市東安路270號復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院內(nèi)《中國癌癥雜志》編輯部

郵 編：200032

電 話：021-64188274；021-64175590×3574

網(wǎng) 址：www.china-oncology.com

電子郵件：zgaz@163.com

Effects of a small interfering RNA targeting CDK6 gene on the biological behaviors of Ewing’s sarcoma cells

ZHANG Zhong-zu1, HUANG Lu2, YU Zhi-ming1, CHEN Xiang1, HAN Zhi-min1, YANG Dong1, CAO Kai1(1.Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital , Nanchang University, Nanchang Jiangxi 330006, China; 2.Department of Child Health and Care, Jiangxi Maternity and Child Health Hospital, Nanchang Jiangxi 330006, China)

CAO Kai E-mail: osteo.caokai@gmail.com

Background and purpose: Cyclin-dependent kinase 6 (CDK6) is a kind of serine/threonine protein kinase, which has been reported to be over-expressed in the Ewing’s sarcoma cells. However, the biological effects and relative mechanisms of CDK6 on Ewing’s sarcoma cells are really less known. This study aimed to investigate the effects of CDK6 gene on the biological behaviors of Ewing’s carcinoma cells A673 and SK-ES-1, we knocked down CDK6 using a small interfering RNA targeting CDK6. Methods: The A673 and SK-ES-1 cells were transfected with a chemical synthesized small interfering RNA which targets CDK6; The real time-PCR and Western blot assays wereperformed to detected the mRNA and protein expression levels of CDK6 and its downstream genes Rb and P-Rb in both cells transfected with the siRNAs; The CCK-8, flow cytometry (FCM), migration and invasion assays were performed to indentify the proliferation, cell cycle distribution, apoptosis, migration and invasion abilities after the transfection with si-CDK6, respectively. Results: The real time-PCR analysis showed the expression of CDK6 was down-regulated in the A673 and SK-ES-1 cells transfected with si-CDK6 (P＜0.01); Suppression of CDK6 by si-CDK6 inhibited the cell proliferation, induced cell apoptosis and G0/G1-Phase cell cycle arrest (P＜0.01); The cells of A673 migrating through the membrane in untreated group, si-con group and si-CDK6 group were 516.00±58.59, 534.00±124.77 and 192.33±68.92, respectively. The numbers of SK-ES-1 cells were 371.33±29.67, 363.33±60.28 and 200.00±20.00, respectively. The results showed significant differences in statistics (P＜0.01); In the invasion assay, the cells of A673 passed through the Matrigel coated membrane in untreated group, si-con group and si-CDK6 group were 251.00±42.93, 238.67±78.62 and 94.67±23.03, respectively, and the number of SK-ES-1 cells were 310.00±35.36, 302.33±41.31 and 105.00±54.08, respectively. The results showed down-regulation of CDK6 could suppress the cells migration and invasion abilities (P＜0.01); The Western blot analysis showed the protein levels of CDK6 and its downstream gene phospho-retinoblastoma gene (P-Rb) were down-regulated, while there were no changes in the expression of Rb after transfection.Conclusion: CDK6 siRNA specifically and efficiently blocks the constitutively activated CDK6 in human Ewing’s sarcoma cells, resulting in inhibition in cell proliferation, migration, invasion and induction of cell apoptosis.

Ewing’s sarcoma; RNA interference; CDK6

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.10.002

R73-36

：A

：1007-3639(2013)10-0784-09

2013-06-14

2013-09-08）

國家自然科學(xué)基金(No: 81060221，81260399)；江西省自然科學(xué)基金(No: 2009GQY0204)；江西省科技計劃支撐項(xiàng)目(No: 20132BBG70068)；江西省教育廳科研項(xiàng)目(No: GJJ12082)。

曹凱 E-mail:osteo.caokai@gmail.com