汪姍姍王寧于嘯,2楊晨曦閆麗萍王言奎

1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東 青島266003；

2.青島市婦女兒童醫(yī)療保健中心婦產(chǎn)科，山東 青島266011

宮頸癌細(xì)胞系RASSFIA基因啟動(dòng)子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)的研究

汪姍姍1王寧1于嘯1,2楊晨曦1閆麗萍1王言奎1

1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東 青島266003；

2.青島市婦女兒童醫(yī)療保健中心婦產(chǎn)科，山東 青島266011

背景與目的：抑癌基因Ras相關(guān)區(qū)域家族1A (Ras association domain family 1A，RASSF1A)啟動(dòng)子及第1外顯子區(qū)CG位點(diǎn)高甲基化導(dǎo)致該基因沉默與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。本研究旨在探討宮頸癌細(xì)胞系RASSFIA基因啟動(dòng)子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)以及甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-Aza-2’deoxycytidine，5-Aza-dc)作用對(duì)RASSFIA基因表達(dá)的影響。方法：采用5 μmol/L(低濃度)和10 μmol/L(高濃度)的5-Aza-dc作用于HeLa、Caski、HT-3以及C-33A等4種宮頸癌細(xì)胞系，分別采用甲基化特異PCR (methylation-specific PCR，MSP)和亞硫酸鹽基因組測(cè)序法(bisulfite genome sequencing，BGS)檢測(cè)5-Aza-dc處理前后RASSF1A基因啟動(dòng)子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)，RT-PCR檢測(cè)干預(yù)前后RASSF1A基因mRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。結(jié)果：HeLa和Caski兩種HPV陽(yáng)性細(xì)胞系RASSF1A基因啟動(dòng)子及第1外顯子區(qū)均呈低甲基化狀態(tài)，mRNA表達(dá)陽(yáng)性。低濃度和高濃度5-Aza-dc作用后，mRNA表達(dá)未見(jiàn)明顯改變(FHeLa=3.003，P=0.125；FCaski=0.045，P=0.956)。HT-3和C-33A兩種HPV陰性宮頸癌細(xì)胞系RASSF1A基因啟動(dòng)子及第1外顯子區(qū)則表現(xiàn)為高度甲基化狀態(tài)，mRNA表達(dá)受到抑制。低濃度和高濃度5-Aza-dc作用后，HT-3和C-33A細(xì)胞系RASSF1A基因啟動(dòng)子及第1外顯子區(qū)CG位點(diǎn)甲基化程度降低，檢測(cè)到其mRNA表達(dá)，高濃度5-Aza-dc作用組表達(dá)水平明顯高于低濃度組和細(xì)胞對(duì)照組(FHT-3=18.002，P=0.03；FC-33A=17.179，P=0.03)，LSD-t檢驗(yàn)顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論：HPV陽(yáng)性和HPV陰性宮頸癌細(xì)胞系中RASSFIA基因啟動(dòng)子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)不同；RASSF1A基因啟動(dòng)子及第1外顯子區(qū)的高甲基化可抑制該基因表達(dá)；5-Aza-dc處理可使RASSF1A基因啟動(dòng)子及第1外顯子區(qū)去甲基化，重新激活基因的表達(dá)，這種作用在一定范圍內(nèi)有劑量依賴(lài)性。

Ras相關(guān)區(qū)域家族1A基因；人宮頸癌細(xì)胞系；5-氮雜-2’-脫氧胞苷；DNA甲基化；TA克隆

研究證實(shí)，人類(lèi)腫瘤組織中存在著多種腫瘤抑制基因的高甲基化［1］。某些腫瘤抑制基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化可沉默該基因的表達(dá)，導(dǎo)致該基因失活，進(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生。Ras相關(guān)區(qū)域家族1A (Ras association domain family 1A，RASSF1A)是2000年由Dammann等［2］利用酵母雙雜交篩選從3號(hào)染色體短臂(3p21.3)克隆獲取的新型腫瘤抑制基因(tumor suppressor gene，TSG)，其表達(dá)產(chǎn)物具有調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的功能。有研究表明，RASSF1A表達(dá)缺失是人類(lèi)腫瘤發(fā)生中的一個(gè)早期普遍事件［3］。胰腺癌、胃癌等多種人類(lèi)腫瘤組織中可檢測(cè)到RASSF1A啟動(dòng)子的異常高甲基化［4-5］。Kuzmin等［6］在10%的宮頸鱗狀細(xì)胞癌、21%的宮頸腺鱗癌以及24%的宮頸腺癌組織中也發(fā)現(xiàn)RASSFIA基因啟動(dòng)子的高甲基化。

本研究選擇4種宮頸癌細(xì)胞系作為研究對(duì)象，檢測(cè)其RASSFIA基因啟動(dòng)子及第1外顯子區(qū)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，探討HPV感染與RASSFIA基因啟動(dòng)子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)的關(guān)系。分析甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-Aza-2’deoxycytidine，5-Aza-dc)對(duì)RASSFIA基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化逆轉(zhuǎn)以及誘導(dǎo)RASSFIA基因重新表達(dá)的作用，明確高甲基化是否影響該基因的表達(dá)，為進(jìn)一步篩選HPV相關(guān)宮頸癌表觀遺傳學(xué)分子標(biāo)志提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系

HPV18陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞系HeLa及HPV陰性宮頸癌細(xì)胞系HT-3為青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存，HPV16陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞系Caski購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所，HPV陰性宮頸癌細(xì)胞系C-33A購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。均用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基(購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司)，37 ℃、飽和濕度、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.2 5-Aza-dc處理

取3×105個(gè)/mL指數(shù)生長(zhǎng)期上述4種宮頸癌細(xì)胞，于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶過(guò)夜培養(yǎng)后，加5-Azadc(購(gòu)自Sigma公司)處理，實(shí)驗(yàn)包括5 μmol/L(低濃度)和10 μmol/L(高濃度)。每24 h更換培養(yǎng)基，維持5-Aza-dc濃度；以不加5-Aza-dc處理組作為對(duì)照，培養(yǎng)5 d后收集各組細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞DNA的亞硫酸鹽修飾

胰蛋白酶消化收集上述各組細(xì)胞，PBS輕洗細(xì)胞3次后，離心收集細(xì)胞沉淀，酚-氯仿-異戊醇法常規(guī)提取細(xì)胞DNA，分別取各組細(xì)胞DNA 5 μg，參照文獻(xiàn)［7］進(jìn)行焦亞硫酸鹽修飾。采用DNA 純化試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)對(duì)修飾后的DNA進(jìn)行脫鹽純化處理，用50 μL TE緩沖液洗脫經(jīng)過(guò)脫鹽純化的DNA，室溫下靜置5 min，加3 mol/L的NaOH 5.56 μL，37 ℃水浴15 min，再加新鮮配制的9 mol/L NH4OAc (pH=7.0)，3 mol/L NaOAc (pH=5.2) 使其脫磺化基團(tuán)。50 μL TE洗脫最終純化的DNA，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 甲基化特異PCR (methylation-specific PCR, MSP)

參照文獻(xiàn)［8］設(shè)計(jì)合成檢測(cè)RASSF1A基因啟動(dòng)子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)的特異性引物(表1)。取亞硫酸鹽修飾處理后的各組細(xì)胞DNA為模板，陰性對(duì)照為無(wú)菌純水。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果，每次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證。

1.5 亞硫酸鹽基因組測(cè)序法(bisulfite genome sequencing, BGS)

引物采用Methy primer express v1.0軟件設(shè)計(jì)，序列及反應(yīng)條件見(jiàn)表1。反應(yīng)體系包括：TaqHS (5 U/μL) 0.25 μL、10×PCR Buffer (含Mg2+) 5 μL、dNTPs (各2.5 mmol) 4 μL、上游及下游引物各(10 μmol) 1 μL、0.05 μg修飾后細(xì)胞DNA作為模板、去離子水加至50 μL。PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定擴(kuò)增結(jié)果。

1.6 TA克隆測(cè)序

凝膠成像系統(tǒng)長(zhǎng)波紫外燈下自瓊脂糖凝膠切取目的PCR產(chǎn)物，采用德國(guó)QIAGEN公司DNA純化試劑盒回收純化。將純化產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆連接，PMD18-T載體試劑盒購(gòu)自TakaRa公司，操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌后氨芐LB平板培養(yǎng)，至長(zhǎng)出藍(lán)白單克隆菌落。取微量白色菌落作為模板進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證， 將陽(yáng)性單克隆菌落接種至含有氨芐抗性LB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，取5 mL菌液送北京華大基因測(cè)序。應(yīng)用MegAlign (DNASTAR, Inc, Madison, WI)和ChromasLite軟件(Technelysium Pty Ltd, Eden Prairie, MN)與基因組序列(NM號(hào)：170714)進(jìn)行比對(duì)分析。

1.7 RT-PCR檢測(cè)RASSFIA基因mRNA表達(dá)

TRIzol一步法提取各組細(xì)胞總RNA，采用Thermo公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，RTPCR檢測(cè)5-Aza-dc作用組及對(duì)照組RASSFIA基因mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)的差異。同時(shí)以管家基因葡萄糖磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內(nèi)參照。擴(kuò)增用引物參照文獻(xiàn)［8］合成(表2)。

表 1 MSP和BGS所用引物序列及反應(yīng)條件Tab. 1 The primer sequences and reaction conditions of MSP and BGS

表2 RT-PCR引物序列及反應(yīng)條件Tab. 2 The primer sequences and reaction conditions of RT-PCR

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較5-Aza-dc作用前后4種宮頸癌

細(xì)胞系中RASSFIA基因mRNA表達(dá)差異采用單因素方差分析，方差齊者組內(nèi)比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RASSFIA基因啟動(dòng)子及第1外顯子區(qū)甲基化檢測(cè)結(jié)果

MSP結(jié)果顯示，2種HPV陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞系HeLa和Caski中，細(xì)胞對(duì)照組、低濃度及高濃度5-Aza-dc處理組只出現(xiàn)U條帶；而在2種HPV陰性宮頸癌細(xì)胞系HT-3和C-33A，細(xì)胞對(duì)照組只出現(xiàn)M條帶，低濃度和高濃度5-Aza-dc作用后，2種細(xì)胞系均為M+U條帶(圖1A)。BGS擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后可觀察到704 bp的特異性目的片段(圖1B)。

圖 1 MSP和BGS檢測(cè)4種宮頸癌細(xì)胞系5-Aza-dc作用前后RASSFIA基因甲基化電泳結(jié)果Fig. 1 The results of RASSFIA gene promoter and exon 1 methylation detected by MSP and BGS in cervical cancer cell lines

2.2 RASSFIA基因啟動(dòng)子及第1外顯子CpG位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果

將BGS產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆后，分別選取HeLa、Caski、HT-3及C-33A等4種宮頸癌細(xì)胞系各10個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)RASSFIA基因啟動(dòng)子及第1外顯子區(qū)64個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。結(jié)果顯示2種HPV陽(yáng)性細(xì)胞系HeLa及Caski中，除個(gè)別位點(diǎn)發(fā)生甲基化外，其余位點(diǎn)均未發(fā)生甲基化；而2種HPV陰性宮頸癌細(xì)胞系HT-3及C-33A則表現(xiàn)為幾乎所有位點(diǎn)的甲基化(圖2A)。兩種不同濃度5-Aza-dc作用于HT-3和C-33A細(xì)胞系后，甲基化程度降低(圖2B)。截取HPV陰性HT-3細(xì)胞系5-Aza-dc作用前后部分序列測(cè)序信號(hào)結(jié)果，未見(jiàn)套峰及雜峰現(xiàn)象(圖3)，測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

圖 2 4種宮頸癌細(xì)胞系RASSFIA基因啟動(dòng)子及第1外顯子區(qū)TA克隆測(cè)序結(jié)果Fig. 2 CpG methylation status of RASSFIA gene promoter and exon 1 detected by TA clone and BGS

圖 3 HPV陰性細(xì)胞系HT-3 RASSFIA基因啟動(dòng)子部分位點(diǎn)甲基化狀態(tài)測(cè)序結(jié)果Fig. 3 Sequencing results of RASSFIA gene promoter and exon 1 in HT-3 cell line.

2.3 5-Aza-dc作用對(duì)RASSFIA基因mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，2種HPV陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞5-Aza-dc處理前后均可檢測(cè)到RASSFIA基因的表達(dá)(圖4)，經(jīng)單因素方差分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FHeLa=3.003，P=0.125；FCaski=0.045，P=0.956)。而2種HPV陰性宮頸癌細(xì)胞系HT-3和C-33A在5-Aza-dc處理前RASSFIA基因表達(dá)缺失，2種不同濃度的5-Aza-dc處理后可以檢測(cè)到RASSFIA基因重新表達(dá)，RASSFIA基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)隨5-Aza-dc濃度升高而增強(qiáng)(FHT-3=18.002，P=0.03；FC-33A=17.179，P=0.03)，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)呈劑量依賴(lài)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表3)。

3 討 論

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)異常表觀遺傳調(diào)控現(xiàn)象在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中更為重要，也更為普遍，其中DNA高甲基化的抑癌基因是人類(lèi)癌癥中最穩(wěn)定的標(biāo)志［9］。抑癌基因的高甲基化可導(dǎo)致其表達(dá)缺失，進(jìn)而失去對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的負(fù)性調(diào)控作用。DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Azadc是一種嘧啶核苷類(lèi)似物，可與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶形成共價(jià)復(fù)合物而阻止DNA的甲基化，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)某些基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化CpG位點(diǎn)，重新激活由于高甲基化而沉默的腫瘤抑制基因，恢復(fù)表達(dá)發(fā)揮其抗腫瘤作用［10-11］。

RASSFIA基因是Ras相關(guān)區(qū)域家族中最重要的成員，其啟動(dòng)子區(qū)域包含20個(gè)CpG位點(diǎn)，第1外顯子區(qū)域含有44個(gè)CpG位點(diǎn)，編碼產(chǎn)物由340個(gè)氨基酸組成，有與RAS蛋白結(jié)構(gòu)相關(guān)的區(qū)域，可通過(guò)三磷酸鳥(niǎo)苷酸依賴(lài)的形式與RAS蛋白相互作用，誘導(dǎo)細(xì)胞衰老和凋亡。另外，RASSFIA 可在翻譯水平上抑制細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1的集聚，阻止細(xì)胞從G1期到S的轉(zhuǎn)變，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯，具有維持基因穩(wěn)定、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用［12］。

本研究結(jié)果顯示2種HPV陰性細(xì)胞系中RASSFIA基因啟動(dòng)子及第1外顯子區(qū)域CpG位點(diǎn)表現(xiàn)為高甲基化狀態(tài)，RASSFIA基因不表達(dá)；5-Aza-dc作用后可以降低RASSFIA基因的甲基化水平，誘導(dǎo)該基因恢復(fù)表達(dá)，且高濃度作用組表達(dá)水平高于低濃度作用組。表明適當(dāng)濃度的5-Aza-dc可通過(guò)干預(yù)抑癌基因RASSFIA高甲基化的調(diào)控序列，恢復(fù)其表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞周期的阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，RASSFIA基因表達(dá)沉默可能是由異常的表觀遺傳機(jī)制調(diào)控。在某些情況下DNA 甲基化是腫瘤抑制基因失活唯一機(jī)制，Paulsen等［13］研究發(fā)現(xiàn)，在肝細(xì)胞癌、卵巢癌、小細(xì)胞性肺癌等腫瘤細(xì)胞中，RASSF1A 基因啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)呈高甲基化，導(dǎo)致基因失活，表達(dá)沉默，提示RASSFIA基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化是頻發(fā)事件。

本研究結(jié)果顯示，2種HPV陽(yáng)性細(xì)胞系RASSFIA基因啟動(dòng)子及第1外顯子區(qū)未發(fā)生甲基化，可檢測(cè)到RASSFIA基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。Kuzmin等［6］采用亞硫酸氫鈉結(jié)合限制性內(nèi)切酶分析法(COBRA)分析了6種HPV陽(yáng)性細(xì)胞系和2種HPV陰性細(xì)胞系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6種HPV陽(yáng)性細(xì)胞系中RASSFIA基因啟動(dòng)子區(qū)均呈低甲基化狀態(tài)；而2種HPV陰性細(xì)胞系則呈完全高甲基化狀態(tài)，與本研究結(jié)果相符合。盡管6種HPV陽(yáng)性細(xì)胞系RASSFIA基因啟動(dòng)子區(qū)均呈低甲基化狀態(tài)，但不同細(xì)胞系RASSFIA基因表達(dá)水平有所不同，HPV16陽(yáng)性(SiHa，CaSki)和HPV18陽(yáng)性(HeLa，C-4I)細(xì)胞系其表達(dá)水平高于HPV39陽(yáng)性(ME180)和HPV45陽(yáng)性(MS751)細(xì)胞系。Dong等［14］對(duì)來(lái)源于頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的7種細(xì)胞系和46例原發(fā)性癌組織中RASSFIA基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與高危型HPV感染之間的關(guān)系進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)兩者之間存在顯著負(fù)相關(guān)(P=0.038)。而Yu等［15］和Cohen等［16］對(duì)宮頸癌組織中的相關(guān)研究卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)兩者之間上述關(guān)系。因此，在RASSFIA基因滅活與HPV感染之間是否真正存在互斥的關(guān)系，仍需要大樣本、多地區(qū)及多種族人群的深入研究。

Pronina等［17］采用半定量RT-PCR系統(tǒng)研究了腎臟、肺臟、卵巢、乳腺、直腸5個(gè)部位130例原發(fā)性上皮腫瘤及相應(yīng)正常對(duì)照組織RASSFIA mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與正常上皮組織比較，腎細(xì)胞癌、乳腺癌、直腸癌、卵巢癌組織中RASSFIA mRNA的表達(dá)水平增高2～7倍，其中以腎細(xì)胞癌和卵巢癌組織更為明顯；在鱗狀細(xì)胞肺癌的早期臨床階段RASSFIA mRNA表達(dá)量增加，而在晚期臨床階段其表達(dá)量降低。表明RASSFIA基因表達(dá)具有腫瘤特異性，RASSFIA基因在腫瘤中可能具有雙重功能，不僅是腫瘤抑制基因，在某些特定的條件下可能同時(shí)是致瘤基因。結(jié)論基于RASSFIA基因5個(gè)外顯子在肺癌、宮頸癌、乳腺癌等癌組織中存在高頻率的單堿基突變［18］。如經(jīng)典的抑癌基因p53因?yàn)槟承┩蛔円矔?huì)獲得致瘤的特性［19］。腫瘤抑制基因RBSP3/CTDSPL在體外能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和裸鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)，但是由于某些突變，在原發(fā)性惡性腫瘤中也會(huì)檢測(cè)到基因的mRNA表達(dá)水平較正常組織升高［18,20］。

本研究表明HPV陰性細(xì)胞系中RASSFIA基因的高甲基化可導(dǎo)致其表達(dá)沉默或表達(dá)下調(diào)，5-Aza-dc可逆轉(zhuǎn)RASSFIA基因的高甲基化，使沉默的RASSFIA基因重新表達(dá)。在HPV陽(yáng)性細(xì)胞系RASSFIA基因呈低甲基化，可檢測(cè)到其mRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。高危型HPV感染與RASSFIA基因沉默的互斥關(guān)系目前仍無(wú)法解釋?zhuān)琄uzmin等［6］研究提示E6和E7蛋白可能不僅僅干擾Rb和p53相關(guān)的腫瘤抑制機(jī)制，也可能涉及Ras信號(hào)通路等其它基本的通路，進(jìn)而影響RASSFIA蛋白的功能，使其喪失抑癌基因功能。而Kashuba等［18］研究提示HPV感染也可引起RASSFIA基因某些特定的堿基突變，導(dǎo)致其編碼產(chǎn)物結(jié)構(gòu)或功能改變而獲得致瘤的功能。因此在不同類(lèi)型宮頸癌腫瘤細(xì)胞中，RASSFIA基因可能存在不同的滅活途徑，通過(guò)不同方式影響其編碼產(chǎn)物的抑癌功能，HPV感染與RASSFIA基因表達(dá)在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的意義尚有待進(jìn)一步研究。

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Study on methylation status of RASSFIA gene promoter and exon 1 in cervical cancer cell lines

WANG Shan-shan1, WANG Ning1, YU Xiao1,2, YANG Chen-xi1, YAN Li-ping1, WANG Yan-kui1(1. Department of Obstetrics and Gynecology, Affiliate Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao Shandong 266003, China; 2. Department of Obstetrics and Gynecology, Qingdao Women and Children Medical Healthcare Center, Qingdao Shandong 266011, China)

WANG Yan-kui E-mail: qdwangyk@hotmail.com

Background and purpose: Loss or altered expression of Ras association domain family 1A gene (RASSF1A) through DNA methylation has been associated with the pathogenesis of a variety of cancers, which suggests the tumor suppressor function of this gene. This study aimed to explore the effect of DNA methyltransferase inhibitor 5-Aza-2’deoxycytidine (5-Aza-dc) on demethylation and expression of RASSF1A in cervical cancer cell lines. Methods: HPV positive cervical cancer cell lines HeLa and Caski, HPV negative cell lines HT-3 and C-33A were treated with two different concentration of 5-Aza-dc (5 μmol/L, 10 μmol/L). MSP (methylation-specific PCR) and Bisulfite genomic sequencing PCR (BGS) combined with TA clone were used to investigate methylation status of RASSF1A gene promoter and exon 1 before and after treatment of 5-Aza-dc. RASSF1A gene mRNA expressionwas detected by RT-PCR. Results: Two HPV positive cell lines showed hypomethylated RASSF1A promoters and expressed RASSF1A mRNA, and after treatment with 5-Aza-dc, the mRNA expression of RASSF1A did not change significantly (FHeLa=3.003, P=0.125; FCaski=0.045, P=0.956). Two HPV negative cervical cancer cell lines showed hypermethylation status of RASSF1A promoter and silenced RASSF1A. After treatment with 5-Aza-dc, demethylation occurred in the promoter region of RASSF1A gene, which subsequently induced re-expression of this gene in HT-3 and C-33A. The F test (FHT-3=18.002, P=0.03; FC-33A=17.179, P=0.03) and LSD-t test (P＜0.05) demonstrated that significant difference in the expression of RASSF1A was found upon two different concentrations drug treatment.Conclusion: The methylation status of promoter and exon 1 of RASSFIA gene in HPV positive and HPV negative cervical cancer cell lines are different. The promoter hypermethylation is correlated with RASSF1A gene expression in HPV negative cervical cancer cell line HT-3 and C-33A, and plays a key role in RASSF1A silencing. 5-Aza-dc may effectively reverse the methylation status of RASSFIA gene promoter in cervical cancer HT-3 and C-33A cells and reactivate gene expression silenced by aberrant hypermethylation in a dose-dependent manner within certain extent.

Ras association domain family 1A (RASSF1A); Human cervical cancer cell line; 5-Aza-2-deoxycytidine; DNA methylation; TA clone

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.10.001

R737.33

：A

：1007-3639(2013)10-0777-07

2013-07-22

2013-10-08）

國(guó)家自然科學(xué)基金(No：81172480)。

王言奎 E-mail:qdwangyk@hotmail. com