蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院病理科，江蘇 常州，213003

多柔比星誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞PARP-1活性上調(diào)依賴于Kif4A蛋白低表達(dá)

王輝 魯常青 田波 李青 陳銅兵

蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院病理科，江蘇 常州，213003

背景與目的：化療作為乳腺癌術(shù)后治療的重要手段，由其引發(fā)的耐藥現(xiàn)象備受關(guān)注，而耐藥的出現(xiàn)與DNA損傷修復(fù)異常增強(qiáng)密切相關(guān)。驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員4A(kinesin family member 4A，Kif4A)和聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶-1[poly(ADP-ribose)polymerase，PARP-1]是重要的DNA損傷修復(fù)分子。本研究探討Kif4A在多柔比星誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞PARP-1活性上調(diào)中的作用及意義。方法：蛋白質(zhì)印跡法檢測多柔比星處理后乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞Kif4A蛋白表達(dá)及PARP-1活性的變化；并檢測高表達(dá)Kif4A蛋白后，乳腺癌細(xì)胞PARP-1蛋白表達(dá)及其活性變化；流式細(xì)胞技術(shù)檢測多柔比星聯(lián)合PARP-1抑制劑3-氨基苯酰胺(3-Aminobenzamide，3-ABA)干預(yù)后乳腺癌細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果：多柔比星能上調(diào)PARP-1活性并誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞Kif4A蛋白低表達(dá)，兩者都呈濃度和時(shí)間依賴性；高表達(dá)Kif4A后，PARP-1活性被明顯抑制，細(xì)胞凋亡數(shù)增加，而多柔比星能部分逆轉(zhuǎn)由Kif4A高表達(dá)而引起的PARP-1活性抑制。多柔比星和3-ABA都誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，聯(lián)合使用能增加細(xì)胞凋亡，與單獨(dú)使用比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果還顯示，多柔比星、PARP-1抑制劑3-ABA及高表達(dá)的Kif4A誘導(dǎo)的MDA-MB-231細(xì)胞凋亡數(shù)高于MCF-7細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論：多柔比星誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞PARP-1活性上調(diào)依賴于細(xì)胞Kif4A蛋白低表達(dá)，Kif4A有望成為逆轉(zhuǎn)多柔比星耐藥的新靶點(diǎn)。

驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員4A；聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶-1；多柔比星；MCF-7細(xì)胞；MDA-MB-231細(xì)胞

多柔比星是臨床上常用的化療藥物，能與DNA發(fā)生交聯(lián)，抑制DNA復(fù)制，阻斷細(xì)胞分裂，達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。然而最近臨床用藥顯示，多柔比星的化療特別是對(duì)乳腺癌的化療耐藥現(xiàn)象常見，而化療耐藥原因可能與腫瘤細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力異常增強(qiáng)有關(guān)。聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶-1［poly(ADP-ribose) polymerase，PARP-1］在DNA損傷修復(fù)中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)多柔比星能上調(diào)多種乳腺癌細(xì)胞PARP-1的活性［1-2］。本研究通過實(shí)驗(yàn)證明驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員4A(kinesin family member 4A，Kif4A)在多柔比星誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞PARP-1活性上調(diào)中起著重要作用，為乳腺癌耐藥研究提供線索。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞及試劑

1.1.1 細(xì)胞株

乳腺癌細(xì)胞MCF-7購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫，乳腺癌細(xì)胞MDAMB-231購于南京凱基生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑

DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液購于Invitrogen公司；胎牛血清購于美國Hyclone公司；一抗Kif4A多克隆抗體和PAR多克隆抗體購于SAB公司，PARP多克隆抗體和α-tubulin多克隆抗體購于Cell Signaling公司；二抗HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗及羊抗兔二抗購于Amersham公司；多柔比星購于美國Sigma公司；PARP-1抑制劑3-氨基苯酰胺(3-Aminobenzamide，3-ABA)購于Amresco公司；AnnexinⅤ-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于南京凱基生物有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞均用含10%滅活胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素和2 mmol/L谷氨酰胺的高糖DMEM完全培養(yǎng)液，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天用0.25%胰蛋白酶和0.5% EDTA混合液傳代。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞處理

接種MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞(MCF-7細(xì)胞接種密度為3×105個(gè)細(xì)胞/孔，MDA-MB-231細(xì)胞接種密度為5×105個(gè)細(xì)胞/孔，下面實(shí)驗(yàn)細(xì)胞接種密度與此相同)于6孔板中，次日換新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液2 mL，分別用0.05、0.1、0.5、1、2 μmol/L的多柔比星處理MCF-7細(xì)胞24 h，恢復(fù)12 h，裂解細(xì)胞，收集蛋白，備用與蛋白印跡法檢測。以不加多柔比星細(xì)胞為對(duì)照組(0 μmol/L)。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。

1 μmol/L濃度多柔比星處理MCF-7/MDAMB-231細(xì)胞24 h，分別在恢復(fù)6、12、24和48 h后，用PBS洗細(xì)胞2次，裂解細(xì)胞，收集蛋白，并進(jìn)行蛋白定量，備用與蛋白印跡法檢測。以不給予恢復(fù)時(shí)間細(xì)胞組為對(duì)照組。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。

構(gòu)建并轉(zhuǎn)染HA-Kif4A質(zhì)粒至MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中，1 μmol/L濃度的多柔比星處理24 h，恢復(fù)12 h，裂解細(xì)胞，收集蛋白，并進(jìn)行蛋白定量，備用與蛋白印跡法檢測。以轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒和未加多柔比星細(xì)胞組為對(duì)照組。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。

接種MCF-7/MDA-MB-231細(xì)胞，用1 μmol/L濃度的多柔比星聯(lián)合5 μmol/L濃度的3-ABA分別處理MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞24 h，恢復(fù)12 h，收取上清液及培養(yǎng)皿底部貼壁細(xì)胞，用PBS洗滌2次，用FCM法檢測細(xì)胞凋亡。以不加多柔比星和3-ABA的MCF-7細(xì)胞組為對(duì)照組。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)

Western blot檢測Kif4A、PARP-1的表達(dá)及PARP-1的活性，用細(xì)胞裂解液提取各組總蛋白；考馬斯亮藍(lán)比色法測定蛋白含量，取等量蛋白進(jìn)行8%的SDS-PAGE凝膠電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，非特異性封閉；加入抗Kif4A多克隆抗體、抗PARP-1多克隆抗體、抗PAR多克隆抗體及抗α微管蛋白多克隆抗體，4 ℃過夜；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)的二抗進(jìn)行雜交2 h。ECL發(fā)光劑溫浴5 min，曝光、顯影、定影。用α微管蛋白作為內(nèi)參。數(shù)碼成像分析系統(tǒng)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行光密度分析，目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量=(待檢測蛋白光密度/α微管蛋白光密度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 RT-PCR檢測

提取HEK293(購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫)細(xì)胞總RNA，并以其為模板，擴(kuò)增Kif4A；Kif4A引物序列：上游5’-TGAAGC TTACATGAAGGAAGAGGTGAAG-3’；下游5’-AGATGTCGACTCCAACTTCAGTGGG-3’，反應(yīng)條件94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃4.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min 。

1.5 FCM法檢測細(xì)胞凋亡

按實(shí)驗(yàn)要求處理MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞，用不含EDTA胰酶消化收集細(xì)胞，合并上清液和細(xì)胞，用PBS再洗滌2次，然后用500 mL結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，加入5 mL的AnnevinⅤ-FITC混勻，加入5 mL的PI混勻，室溫避光反應(yīng)5～15min，流式細(xì)胞儀檢測(1 h內(nèi)完成細(xì)胞檢測)。計(jì)算細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以x±s 表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，再用Tukey post hoc進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 多柔比星對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDAMB-231表達(dá)Kif4A和PARP-1的影響

分別用0.05、0.1、0.5、1和2 μmol/L濃度多柔比星干預(yù)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞24 h，恢復(fù)12 h，以不加多柔比星細(xì)胞為對(duì)照組(0 μmol/L)，蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，隨著多柔比星濃度的升高，MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞PARP-1活性即多聚核糖基化修飾［poly(ADP-ribose)，PAR］在整個(gè)過程中逐漸增強(qiáng)，在1 μmol/L時(shí)，其活性是對(duì)照組(0 μmol/L)的2倍以上，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；相反Kif4A蛋白卻呈現(xiàn)出逐漸低表達(dá)，在多柔比星濃度為1 μmol/L時(shí)，Kif4A蛋白基本不表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；而全長PARP-1(113×103)蛋白表達(dá)在整個(gè)過程中變化不大，其斷裂(89×103)略有減少(圖1)。

1 μmol/L濃度多柔比星處理MCF-7細(xì)胞24 h，分別恢復(fù)6、12、24、48 h，以未處理組和不予恢復(fù)時(shí)間作為對(duì)照組，蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，多柔比星處理后隨著恢復(fù)時(shí)間的延長，兩種細(xì)胞的PARP-1活性PAR都呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢，在多柔比星處理后不予恢復(fù)時(shí)間組中PAR被抑制，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；相反Kif4A蛋白卻呈現(xiàn)出逐漸低表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；而全長PARP-1蛋白表達(dá)在整個(gè)過程中變化不大，隨著恢復(fù)時(shí)間的延長，斷裂PARP-1略有減少，與加入多柔比星但不予恢復(fù)時(shí)間組相比較，給予恢復(fù)時(shí)間組PARP-1斷裂減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖2)。

2.2 Kif4A高表達(dá)對(duì)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞表達(dá)PARP-1及其活性的影響

圖 1 蛋白質(zhì)印跡法檢測不同濃度多柔比星處理MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞24 h且恢復(fù)12 h后Kif4A及PARP-1的表達(dá)情況Fig. 1 The expressions of Kif4A and PARP-1 after treatment with epirubicin for 24 h, and recovery for 12 h were detected by Western blot in MCF-7 and MDA-MB-231 cells.

圖 2 蛋白質(zhì)印跡法檢測1 μmol/L濃度多柔比星處理MCF-7細(xì)胞24 h，恢復(fù)不同時(shí)間后Kif4A及PARP-1的表達(dá)情況Fig. 2 The expression of Kif4A and PARP-1 after treatment with 1 μmol/L epirubicin for 24 h and recovery for different time were detected by Western blotting in MCF-7 and MDA-MB-231 cells

構(gòu)建HA-Kif4A(結(jié)果未顯示)，轉(zhuǎn)染HAKif4A至MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)，1 mmol/L濃度多柔比星處理24 h，恢復(fù)12 h，裂解細(xì)胞，蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示：Kif4A的高表達(dá)能明顯抑制MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的PARP-1活性，與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空載體組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而多柔比星能部分逆轉(zhuǎn)由外源性Kif4A高表達(dá)引起的PARP-1活性抑制；多柔比星處理組PARP-1活性明顯增強(qiáng)，與不加多柔比星相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖3)。

2.3 多柔比星聯(lián)合3-ABA作用對(duì)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響

圖 3 蛋白質(zhì)印跡法檢測Kif4A高表達(dá)后1 μmol/L濃度多柔比星處理MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞24 h、恢復(fù)12 h后PARP-1蛋白表達(dá)或活性的情況Fig. 3 The expression of PARP-1 after transfected HA-Kif4A plasmid and treated with 1 μmol/L epirubicin for 24 h and recovery for 12 h by Western blot in MCF-7 and MDA-MB-231 cells

用1 mmol/L濃度多柔比星聯(lián)合5 mmol/L濃度3-ABA處理MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞24 h，恢復(fù)12 h，收取上清液及培養(yǎng)皿底部貼壁細(xì)胞，用PBS洗滌2次，以不加多柔比星和3-ABA為對(duì)照組，F(xiàn)CM法檢測細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示，在MCF-7細(xì)胞，多柔比星及3-ABA都能誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞發(fā)生凋亡，細(xì)胞凋亡率分別為(5.94±0.27)%和(6.90±0.17)%，與對(duì)照組 ［(3.85±0.26)%］相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；兩者聯(lián)合使用能進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，凋亡率為(10.24±0.81)%，與多柔比星及3-ABA單獨(dú)使用相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖4)。

多柔比星及3-ABA都能誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生凋亡，細(xì)胞凋亡率分別為(6.30±0.48)%和(7.83±0.58)%，與對(duì)照組［(3.14±0.67)%)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；兩者聯(lián)合使用則進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，凋亡率為(11.53±0.45)%，與多柔比星和3-ABA單獨(dú)使用相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖4)。

本研究同時(shí)還比較了多柔比星及3-ABA處理后，MCF-7與MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡差異，結(jié)果顯示：多柔比星、3-ABA、多柔比星+3-ABA處理后，MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率分別為(6.30±0.48)%、(7.83±0.58)%和 (11.53±0.45)%，顯著高于MCF-7細(xì)胞相對(duì)應(yīng)處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖4)。

2.4 Kif4A高表達(dá)對(duì)多柔比星誘導(dǎo)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響

圖 4 FCM法檢測多柔比星聯(lián)合3-ABA對(duì)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞凋亡影響Fig. 4 The apoptosis of MCF-7 and MDA-MB-231 cells after treated with PARP-1 inhibitor 3-ABA and epirubicin were detected by FCM

轉(zhuǎn)染HA-Kif4A至MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)，1 mmol/L濃度多柔比星處理24 h，恢復(fù)12 h，收集細(xì)胞，F(xiàn)CM法檢測細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示，Kif4A高表達(dá)后，多柔比星能上調(diào)MCF-7細(xì)胞凋亡，凋亡率為(9.23±0.70)%，與HA-pcDNA+多柔比星組［(7.19±0.75)%)和HAKif4A組［(6.80±0.23)%］相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；HA-Kif4A高表達(dá)也能誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡，凋亡率為(6.80±0.23)%，與HA-pcDNA組［(4.48±0.42)%］和對(duì)照組MCF-7組［(4.10±0.58)%］相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

Kif4A高表達(dá)后，多柔比星能上調(diào)MDAMB-231細(xì)胞凋亡，凋亡率為(11.40±0.63)%，與HA-pcDNA+多柔比星組［(7.10±0.61)%］和HA-Kif4A組［(8.36±0.79)%］相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；HA-Kif4A高表達(dá)也能誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡，凋亡率為(8.36±0.79)%，與HA-pcDNA組［(4.44±0.36)%］和對(duì)照的MDA-MB-231組［(3.85±0.66)%］相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

本研究同時(shí)還比較在Kif4A高表達(dá)后MCF-7與MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡差異，結(jié)果顯示，HA-Kif4A、HA-Kif4A+3-ABA處理后，MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率分別為(8.36±0.79)%和(11.40±0.63)%，與相對(duì)照的MCF-7細(xì)胞組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖5)。

圖 5 FCM法檢測Kif4A高表達(dá)對(duì)多柔比星誘導(dǎo)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 The apoptosis of MCF-7 and MDA-MB-231 cells after transfected with HA-Kif4A plasmid and treated with 1 μmol/L epirubicin were detected by FCM

3 討 論

多柔比星作為一種常用的乳腺癌化療藥物，在乳腺癌的治療中起著重要作用，然而由其引起的化療耐藥也越來越多［3］。研究表明P-糖蛋白(permeability glycoprotein，P-gp)［4］、乳腺癌耐藥蛋白(breast cancerresistance protein，BCRP)、耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associated proteins，MRPs)［5］、乳腺癌易感基因BRCA1(breast cancer associated 1，BRCA1)［6］、PARP-1［7］在癌癥化療耐藥中都起重要作用。Nelson等［8］研究前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌患者化療干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，在腫瘤附近的正常細(xì)胞(成纖維細(xì)胞)的DNA被化療破壞時(shí)，也會(huì)向腫瘤微環(huán)境中釋放一種稱為WNT16B的蛋白，這種蛋白的高表達(dá)導(dǎo)致癌細(xì)胞生長、侵入附近組織并減弱了化療藥物在機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞毒性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活、加速癌癥病理過程。Daemen等［9］和Hiller等［10］研究結(jié)果顯示，BRCA1突變的乳腺癌和(或)三陰性乳腺癌對(duì)PARP-1抑制劑治療較多柔比星敏感，提示多柔比星處理后可能上調(diào)了PARP-1活性，增強(qiáng)了其損傷修復(fù)功能。Munoz-gamez等［2］在研究乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞時(shí)也發(fā)現(xiàn)，多柔比星處理后PARP-1活性能迅速上調(diào)，增強(qiáng)細(xì)胞損傷修復(fù)功能抑制MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡。Midorikawa等［11］在研究大腦神經(jīng)元發(fā)育中發(fā)現(xiàn)Kif4A可通過其羧基末端直接與PARP-1相結(jié)合，抑制PAPR-1的活性，介導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，提示Kif4A在調(diào)節(jié)PARP-1活性中起著重要作用。

Kif4A屬于驅(qū)動(dòng)蛋白(kinesin)超級(jí)家族，是以微管為軌道的分子馬達(dá)(molecular motor)［12］。Kif4A蛋白含有N端保守的馬達(dá)區(qū)(motor domain)、中間的卷曲螺旋頸區(qū)(neck region)和C端的尾區(qū)(tail domain)［13］。其馬達(dá)區(qū)具有ATP酶活性，能通過水解ATP獲得能量，改變構(gòu)型，使Kif4A在以微管構(gòu)成的軌道上進(jìn)行滑行；而在Kif4A頸區(qū)，存在核定位信號(hào)(nuclear localization signal，NLS)，使Kif4A能分布在細(xì)胞內(nèi)和具有結(jié)合DNA的能力，這為Kif4A參與調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)途徑提供了可能；而Kif4A的尾區(qū)有一些分布規(guī)律的半胱氨酸，既可結(jié)合貨物(cargo)，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)物資運(yùn)輸，又可結(jié)合相關(guān)蛋白，調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)途徑，參與細(xì)胞有絲分裂過程中染色體的固縮、仿垂體的形成及分離等［14-15］。

PARP-1是存在于真核細(xì)胞中催化聚ADP核糖化的細(xì)胞核酶，其參與的聚ADP核糖化是真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)翻譯后的重要修飾方式之一［16］。PARP-1的相對(duì)分子質(zhì)量為113×103，其蛋白由6個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：其中Zn1、Zn2結(jié)構(gòu)域中存在核定位信號(hào)(nuclear localization signal，NLS)和KRK-X(11)-KKKSKK序列，使其具有DNA結(jié)合能力，故Zn1、Zn2結(jié)構(gòu)域也稱為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-binding domain，DBD)；而BRCT結(jié)構(gòu)域與WGR結(jié)構(gòu)域之間有一個(gè)富含賴氨酸和谷氨酸的高度保守的聚ADP核糖基化［poly(ADP-ribose)，PAR］結(jié)合位點(diǎn)，這為PARP-1催化結(jié)構(gòu)域CAT介導(dǎo)PAR修飾提供了可能；Zn3是PARP-1中相對(duì)比較保守的結(jié)構(gòu)域，其主要功能是與WGR結(jié)構(gòu)域一同參與調(diào)節(jié)PAR修飾［17］。PARP-1可作為NF-kB和低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor，HIF1)的協(xié)同刺激因子調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，并且能與堿基切除修復(fù)因子(base excision repair，BER) 和X線修復(fù)交叉互補(bǔ)基因(X-ray repair cross-complementing，XRCC)結(jié)合，單鏈DNA損傷能誘導(dǎo)PARP-1、XRCC及固縮蛋白Ⅰ表達(dá)增加，上調(diào)PAR修飾，促進(jìn)損傷DNA的修復(fù)［18-19］。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示多柔比星作用后，乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的Kif4A蛋白低表達(dá)，PARP-1活性上調(diào)。高表達(dá)Kif4A后，MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞PARP-1活性明顯被抑制，而多柔比星能部分逆轉(zhuǎn)由外源性Kif4A高表達(dá)引起的PARP-1活性抑制。

多柔比星是通過何種機(jī)制誘導(dǎo)Kif4A低表達(dá)目前還不清楚，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測至少有兩種可能情況：①多柔比星抑制乳腺癌細(xì)胞Kif4A蛋白表達(dá)；②多柔比星殺死乳腺癌細(xì)胞中Kif4A高表達(dá)的細(xì)胞，使Kif4A呈現(xiàn)出低的檢測水平。此外多柔比星并不影響外源性Kif4A蛋白的表達(dá)，提示多柔比星對(duì)Kif4A的影響可能是在翻譯水平(可能是對(duì)啟動(dòng)子的影響)。

多柔比星能誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞后凋亡，PARP-1抑制劑抑制其活性后，細(xì)胞凋亡進(jìn)一步增加。此外，MDA-MB-231細(xì)胞對(duì)PARP-1抑制劑3-ABA作用較MCF-7敏感，原因可能與MDA-MB-231細(xì)胞存在BRCA1突變(MCF-7細(xì)胞BRCA1野生型)有關(guān)。BRCA1作為乳腺癌中重要的一個(gè)損失修復(fù)蛋白，在同源重組修復(fù)發(fā)揮重要作用。已有報(bào)道證實(shí)Kif4A可通過BRCA1-BRCA2途徑參與DNA損傷修復(fù)［15］，BRCA1的突變使該途徑缺失，DNA損傷得不到有效修復(fù)，細(xì)胞凋亡增加。Kif4A的高表達(dá)抑制PARP-1的活性后，乳腺癌細(xì)胞凋亡，與MCF-7細(xì)胞相比，MDA-MB-231細(xì)胞凋亡明顯；高表達(dá)Kif4A后，再用多柔比星處理細(xì)胞，細(xì)胞凋亡也進(jìn)一步增加；原因也可能是Kif4A高表達(dá)后，PARP-1活性明顯被抑制，由其介導(dǎo)的損傷修復(fù)途徑失活，細(xì)胞凋亡增加，而多柔比星處理后，內(nèi)源性Kif4A蛋白低表達(dá)，由其介導(dǎo)的另一條損傷修復(fù)途徑Kif4A-BRCA1-BRCA1失活，使細(xì)胞進(jìn)一步凋亡。然而PARP-1介導(dǎo)的損傷修復(fù)途徑和BRCA1介導(dǎo)的損傷修復(fù)途徑何者起主要作用有待進(jìn)一步研究。

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Epirubicin up-regulates PARP-1 activity dependent on Kif4A low expression in breast cancer cells

WANG Hui, LU Chang-qing, TIAN Bo, LI Qing, CHEN Tong-bing (Department of Pathology, the Third Affiliated Hospital of Suzhou University, Changzhou Jiangsu 213003, China)

LU Chang-qing E-mail: 344575914@qq.com

Background and purpose: Chemotherapy is the important way of breast cancer treatment, but the drug-resistance has attracted special attention. The emergence of drug resistance is closely related to the abnormal enhancement of DNA-damage repair. Both Kif4A and PARP-1 are important molecules of DNA repair. The research investigated the function of Kif4A in epirubicin up-regulating the activity of PARP-1 in breast cancer cells and possible significance. Methods: Western blot was used to detect the expression of Kif4A and PARP-1 after treatment with epirubicin in MDA-MB-231 and MCF-7 cells; the expression of PARP-1 and its activity were detected after high expression of Kif4A and treatment with epirubicin; FCM was used to detect cell apoptosis after treatment with epirubicin combined with PARP-1 inhibitor 3-ABA. Results: Epirubicin up-regulated PARP-1 activity and induced low expression of Kif4A in breast cancer cells, both of them showed dose-dependent and time-dependent. After high expression of Kif4A, the activity of PARP-1 was inhibited and the apoptosis of cells increased, epirubicin partially reversed the activity of PARP-1 inhibited by high Kif4A expression. Both of epirubicin and 3-ABA induced cell apoptosis, combination of them further increased cell apoptosis compared with alone used (P＜0.05). The results also showed the apoptosis rate of MDA-MB-231 cells induced by epirubicin, PARP-1 inhibitor 3-ABA and high expressionKif4A was higher than that of MCF-7 cells (P＜0.05). Conclusion: Epirubicin increases the activity of PARP-1 dependent on the low expression of Kif4A in breast cancer cells. Kif4A might become a novel target for overcoming resistance of epirubicin.

Kif4A; PARP-1; Epirubicin; MCF-7 cell; MDA-MB-231 cell

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.10.005

R737.9

：A

：1007-3639(2013)10-0804-09

2013-08-05

2013-09-30）

魯常青 E-mail:344575914@qq.com