吳星波， 郝俊杰， 張曉艷， 萬述偉， 李紅衛(wèi)， 邵 陽， 孫吉祿

1．青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東青島266100；

2．西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶400715

普通菜豆抗白粉病基因SCAR標(biāo)記鑒定

吳星波1，2， 郝俊杰1?， 張曉艷1， 萬述偉1， 李紅衛(wèi)1， 邵 陽1， 孫吉祿1

1．青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東青島266100；

2．西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶400715

利用8個(gè)來自于普通菜豆抗白粉病基因SCAR標(biāo)記（SAU5、SS18、SF6Em3、SF12R9、SF13R10、SF18R7、SF18R15和SMe1Em5）引物組，對(duì)78份普通菜豆資源進(jìn)行抗白粉病分子標(biāo)記的鑒定。結(jié)果表明：在這78份資源中，SF12R9、SF13R10、SF18R7、SF18R15和SMe1Em5均無擴(kuò)增帶。有52份資源含有SAU5標(biāo)記，66份資源含有SF6Em3標(biāo)記，76份資源含有SS18標(biāo)記。76份資源含有2～3個(gè)標(biāo)記。該研究明確了78份參試菜豆資源所含的抗白粉病基因類型，并篩選出抗白粉病基因聚合體的參試菜豆資源。

普通菜豆；SCAR；菜豆白粉??；抗病基因；分子標(biāo)記

菜豆（Phaseolus vulgaris L．）白粉?。╬owdery mildew，PM）是由真菌病原體核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum Lib．de Bary）侵染引起的，該致病菌多以菌絲體在多年生植株體內(nèi)、花卉上或以閉囊殼在病株殘?bào)w上越冬，在適宜條件下以子囊孢子對(duì)寄主進(jìn)行初侵染，進(jìn)而產(chǎn)生分生孢子進(jìn)行再浸染［1］。菜豆發(fā)生白粉病會(huì)影響菜豆的產(chǎn)量，危害其種子和莢的質(zhì)量，大大降低菜豆的經(jīng)濟(jì)效益［2］。隨著生活水平的提高，藥物防治菜豆白粉病因存在農(nóng)藥殘留隱患已漸漸不為大眾接受，培育抗病新品種成為菜豆防治白粉病主要的農(nóng)業(yè)措施。

目前，分子標(biāo)記已成為作物遺傳育種的重要輔助手段，利用分子標(biāo)記不僅能極大地縮短培育新品種的時(shí)間，實(shí)現(xiàn)多基因的聚合［3，4］，還可用于品種的抗病基因鑒定［5］。國內(nèi)關(guān)于普通菜豆抗炭疽病的SCAR標(biāo)記研究較多，但對(duì)菜豆抗白粉病的SCAR標(biāo)記較少。本研究利用與普通菜豆抗白粉病基因AU05、S18、F13R10、Me1Em5、F12R9、SF6Em3、SF13R15和SF18R7相關(guān)的SCAR標(biāo)記，對(duì)來自國內(nèi)普遍種植的78份普通菜豆種質(zhì)進(jìn)行檢測，明確了其所含抗白粉病基因類型，以便在抗病育種中有效合理地利用。

1 材料與方法

1．1 材料

普通菜豆資源78份，由12份國外資源、56份國內(nèi)資源及10份未知資源構(gòu)成（表1）。

表1 供試普通菜豆資源Table 1 Common bean accessions used in the experiment．

1．2 SCAR標(biāo)記引物序列

SCAR標(biāo)記引物組共 8個(gè)：SAU5、SS18、SF6Em3、SF12R9、SF13R10、SF18R7、SF18R15和 SMe1Em5，分別是普通菜豆中8個(gè)抗白粉病基因AU05、S18、F13R10、Me1Em5、F12R9、SF6Em3、SF13R15和SF18R7的標(biāo)記（表2）。

表2 來自普通菜豆抗白粉病基因的SCAR引物序列Table 2 SCAR primer sequences of powderymildew resistant genes derive from common beans．

1．3 方法

1．3．1 DNA的提取及濃度的測定 采用改良CTAB法［7］提取全基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠和ND?1000核酸測定儀（Nano Drop）測定其純度和濃度，稀釋到25 ng／μL用于PCR擴(kuò)增。提取的基因組總DNA置于-20℃冰箱備用。

1．3．2 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測 PCR反應(yīng)體系（15μL）：PCR MIX（Thermo Fisher）7．5μL，100 mmol／μL引物（上海生工）各0．06μL，25 ng／μL DNA模板1．2μL。采用ABIVeriti梯度PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序視各引物而不同，擴(kuò)增產(chǎn)物放置4℃冰箱備用。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀（Bio?Rad Gel DocTMXR）下觀察照相，統(tǒng)計(jì)有擴(kuò)增條帶的材料序號(hào)。

2 結(jié)果與分析

2．1 群體抗性鑒定結(jié)果

8個(gè)抗白粉病基因引物組在78份菜豆資源中的擴(kuò)增結(jié)果表明，3個(gè)引物組（SAU5、SS18及SF6Em3）能夠在參試資源中得到差異性擴(kuò)增片段（表3）；其余5組引物在所有參試菜豆材料中均無擴(kuò)增帶，這5個(gè)引物不能有效用于參試菜豆抗白粉病基因的標(biāo)記，未列入統(tǒng)計(jì)。

3對(duì)有效抗白粉病病基因引物組對(duì)參試資源的抗性基因鑒定結(jié)果顯示，52份資源含有SAU5標(biāo)記，66份資源含有SF6Em3標(biāo)記，76份資源含有SS18標(biāo)記。

2．2 抗白粉病基因聚合體的篩選

參試資源中普遍存在白粉病抗病基因，主要為單基因或多基因聚合的形式。78份參試資源僅有2份參試資源（MAS68、MAS77）含單個(gè)白粉病抗病基因（SF6Em3），其余76份資源均含2～3個(gè)抗白粉病基因，結(jié)果見表3。圖1、圖2為引物SAU5和SS18在24份參試資源中的擴(kuò)增結(jié)果。

利用菜豆抗白粉病基因AU05、S18、F13R10的 SCAR標(biāo)記，在 78份參試資源中，選擇到AU05＋S18基因聚合的資源6個(gè)；選擇到 S18＋F13R10基因聚合的資源18個(gè)；選擇到AU 05＋S18＋F13R10基因聚合的資源46個(gè)。78份參試菜豆資源中，僅有2份資源未檢測到抗白粉病基因，而篩選出3對(duì)有效的抗白粉病引物SAU5、SS18和SF6Em3，在參試菜豆資源中檢測出含有其對(duì)應(yīng)抗性基因的概率分別為67%、87%和97%，說明大部分參試菜豆資源均含有抗白粉病基因。引物SS18擴(kuò)增的目的片段應(yīng)為1 350 bp，但在參試資源中發(fā)現(xiàn)有900 bp單帶和900／1 350 bp雙帶出現(xiàn)（圖2），表明引物SS18在部分資源特異性擴(kuò)增中出現(xiàn)假陰性，這與Mikleas等［1］的研究結(jié)果相同。

表3 78份材料SCAR標(biāo)記鑒定結(jié)果Table 3 The identification results of SCAR markers in 78 common bean accessions．

圖1 引物對(duì)SAU5在24個(gè)樣品中的擴(kuò)增結(jié)果Fig．1 The amplification result of SS18 primer combination in 24 common bean samples．

圖2 引物對(duì)SS18在24個(gè)樣品中的擴(kuò)增結(jié)果Fig．2 The amplification result of SS18 primer combination in 24 common bean samples．

3 討論

利用抗病品種防治菜豆白粉病已成為世界上一些主要菜豆生產(chǎn)國如美國、加拿大、澳大利亞、印度、英國、西班牙等普遍應(yīng)用的方法。國外對(duì)菜豆白粉病的早期研究表明，普通菜豆對(duì)白粉病菌的侵染表現(xiàn)受單基因或兩個(gè)協(xié)同基因控制［8，9］。Freyre等［10］利用QTL定位，先后在B7及B1連鎖群上定位了菜豆抗白粉病基因；Park等［11］利用QTL定位在B7及B8連鎖群上定位了菜豆抗白粉病基因，并發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因?qū)χ仓甑母叨纫灿杏绊?；Kolkman等［12］在B2和B7連續(xù)群上定位了兩個(gè)菜豆抗白粉病基因。迄今為止，通過QTL方法在各連鎖群上已定位了27個(gè)菜豆抗白粉病基因［13］，這些抗病基因的發(fā)掘，促進(jìn)了分子標(biāo)記輔助育種（MAS）在育種中的應(yīng)用，縮短了高抗白粉病菜豆品種的選育時(shí)間。

普通菜豆于15世紀(jì)從美洲直接引入中國，作為重要的食用豆類作物之一，在我國的許多地區(qū)廣泛種植［14］。我國是世界上菜豆第二大生產(chǎn)國，菜豆的主要病害有菜豆炭疽?。╝nthracnose）、菜豆銹?。╮ust）、菜豆白粉?。╬owdery mildew）、菜豆角斑?。╝ngular leaf spot）、菜豆黃花葉病毒?。╞ean golden mosaic）、菜豆花葉病毒?。╞ean common mosaic）和菜豆細(xì)菌疫病（bacterial blight）等，這些病害的抗病基因都已經(jīng)有分子標(biāo)記報(bào)道。國內(nèi)對(duì)菜豆炭疽病的研究較為深入，如趙曉彥等［15］利用12個(gè)菜豆品種（鑒別寄主）評(píng)價(jià)了7個(gè)抗炭疽病基因SCAR標(biāo)記的可靠性和實(shí)用性，并用5個(gè)可靠的菜豆炭疽病基因SCAR標(biāo)記鑒定了127份普通菜豆抗炭疽病品種中抗炭疽病基因的類型；陳明麗等［16］利用SSR分子標(biāo)記，定位了中國普通菜豆抗炭疽病基因等。

國內(nèi)對(duì)菜豆抗白粉病基因研究比較落后，目前研究發(fā)現(xiàn)的8個(gè)菜豆抗白粉病基因全是來自國外的研究，因此，明確我國現(xiàn)有菜豆資源抗白粉病基因類型，并從國內(nèi)抗白粉病資源中發(fā)掘新的抗病基因，對(duì)我國抗白粉病菜豆的選育具有深遠(yuǎn)意義。本研究明確了78份參試菜豆資源所含的抗白粉病基因類型，篩選出3個(gè)能夠有效用于鑒定菜豆抗白粉病基因的標(biāo)記，選擇到含2個(gè)抗白粉病基因的菜豆資源24份，含3個(gè)抗白粉病基因的菜豆資源46份。上述結(jié)果說明，國內(nèi)抗白粉病菜豆資源較多，含有多個(gè)抗白粉病基因的菜豆資源較為常見。

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Identification of Powdery M ildew Resistant Genes based on SCAR M arkers in Common Bean（Phaseolus vulgaris L．）

WU Xing?bo1，2，HAO Jun?jie1?，ZHANG Xiao?yan1，WAN Shu?wei1，LIHong?wei1，SHAO Yang1，SUN Ji?lu1
1．Qingdao Academy ofAgricultural Sciences，Shandong Qingdao 266100，China；
2．College ofHorticulture and Landscape Architecture，Southwest University，Chongqing 400715，China

Eight SCAR primer combinations（SAU5，SS18，SF6Em3，SF12R9，SF13R10，SF18R7，SF18R15 and SMe1Em5）of common bean powderymildew resistant genes were used to check the genome DNA of 78 common bean accessions．The SCAR primer pairs of SF12R9，SF13R10，SF18R7，SF18R15 and SMe1Em5 did not amplified target bands at all；SAU5 marker appeared in 52 accessions，SF6Em3 marker in 66 accessions，and SS18 marker in 76 accessions．2～3 SCAR markers appeared in 76 accessions respectively．The types of powderymildew resistantgenes in each of the 78 accessions have been identified，and the accessions with pyramiding powderymildew resistance genes were selected．

common bean；SCAR；powderymildew；resistance gene；molecularmarker

10．3969／j．issn．2095?2341．2013．05．09

2013?07?29；接受日期：2013?09?06

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金資助（CARS?09）；農(nóng)業(yè)部“引進(jìn)國際先進(jìn)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)”項(xiàng)目（2012Z?52；2011?G1（3）?08）；青島市農(nóng)科院博士基金項(xiàng)目資助。

吳星波，碩士，研究方向?yàn)槭卟朔肿由飳W(xué)與基因工程。E?mail：wuxingbo＠126．com。?通信作者：郝俊杰，助理研究員，博士，研究方向?yàn)槭卟丝共∮N。E?mail：haojunj＠126．com