葛超榮

浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院，杭州310003

腸道定植產(chǎn)KPC酶植生拉烏爾菌的耐藥基因環(huán)境分析

葛超榮

浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院，杭州310003

碳青霉烯酶編碼基因的傳播是臨床抗菌治療面臨的嚴重威脅之一。采用PCR、Southern雜交、測序比對等方法篩查和研究了碳青霉烯類抗菌藥物的相關耐藥基因。首次在國內(nèi)發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)KPC酸的植生拉烏爾菌兩株。分離到的植生拉烏爾菌對被測試的19種常用抗菌藥物中的16種耐藥，只對多粘菌素B、粘菌素和米諾環(huán)素敏感。它們均產(chǎn)KPC?2型碳青霉烯酶，其編碼基因blaKPC?2位于質(zhì)粒上，兩側(cè)（包括blaKPC?2）長度為7 498 bp的DNA序列所包含的結構從上游至下游分別為Tn3?transposase，Tn3?resolvase，IS Kpn8，blaKPC?2和IS Kpn6?like元件。

植生拉烏爾菌；碳青霉烯酶；質(zhì)粒

碳青霉烯類抗菌藥物是目前所使用的抗菌藥物中針對革蘭陰性菌抗菌譜最廣、抗菌活性最強的一類抗菌藥物，尤其是對產(chǎn)超廣譜β?內(nèi)酰胺酶（extended spectrumβ?lactamases，ESBLs）和 β內(nèi)酰胺酶（AmpC）的腸桿菌科細菌［1］。但隨著該類抗菌藥物在臨床應用的增加，對此類抗菌藥物的耐藥現(xiàn)象也日趨增多。革蘭陰性菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的機制主要有以下幾種：①外膜孔蛋白減少或缺失；②碳青霉烯類抗菌藥物作用靶位，主要為青霉素結合蛋白的改變［2］；③產(chǎn)碳青霉烯酶，主要包括Ambler分類中A類、B類及D類的某些OXA酶［3］，其中，腸桿菌科細菌耐碳青霉烯類抗菌主要由于其產(chǎn)生A類酶中的KPC型碳青霉烯酶［4］。

自從2001年自肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)KPC酶以后［5］，現(xiàn)已在很多種屬的細菌中發(fā)現(xiàn)該酶［6～9］，這些產(chǎn)KPC酶的菌株主要有腸桿菌科細菌，包括大腸埃希氏菌、克雷伯菌屬細菌、腸桿菌屬細菌、枸櫞酸桿菌屬細菌、沙門菌屬細菌、沙雷氏菌屬細菌以及奇異變形桿菌等［10～13］，在其他細菌中也有零星報道，例如銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌和鮑曼不動桿菌等［14～16］。迄今只有于2009年在美國發(fā)現(xiàn)過2株產(chǎn)KPC的植生拉烏爾菌［17］，本文是國內(nèi)首次在植生拉烏爾菌中鑒定到KPC酶。

1 材料與方法

1．1 實驗菌株

2009年8～10月期間，于浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院重癥監(jiān)護室住院病人的糞便／直腸拭子標本中分離獲得碳青霉烯類抗菌藥物敏感性降低的革蘭陰性臨床菌株286株。標準菌株為大腸埃希氏菌Escherichia coli ATCC25922。

1．2 實驗方法

1．2．1 blaKPC?2基因篩查 利用 blaKPC?2擴增引物［18］對286株臨床菌株進行blaKPC-2基因PCR擴增。用煮沸法提取模板DNA（調(diào)成一定濃度的菌懸液煮沸10min，4 000 r／min離心10min，取上清-20℃保存?zhèn)溆茫CR反應體系（50μL）為：模板1．0μL，10×PCR緩沖液 5．0μL，MgCl2（25 mmol／L）4．0μL，dNTPs（10 mmol／L）0．5μL，上下游引物（10μmol／L）各1．0μL，Taq酶（5 U／μL）0．3μL。PCR擴增程序為：94℃預變性5 min；94℃變性50 s，60℃退火30 s，72℃延伸50 s，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴增后用1%瓊脂糖120 V電泳20 min。陽性標本的擴增產(chǎn)物純化后送博賽生物公司測序，測序結果經(jīng)http：／／blast．ncbi．nlm．nih．gov／Blast比對。

1．2．2 藥物敏感性試驗 用E?Test法測定陽性細菌對常見抗菌藥物的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。藥敏判斷標準主要參照CLSI 2013；頭孢哌酮／舒巴坦的判斷標準參照CLSI 2013頭孢哌酮的折點標準［19］；粘菌素和替加環(huán)素的藥敏結果判斷參照歐洲抗菌藥物敏感性試驗委員會推薦的標準（http：／／www．eucast．org／）；多粘菌素B的判斷標準參照粘菌素的藥物敏感性標準。操作嚴格按照廠家說明書進行。

1．2．3 blaKPC?2基因定位 采用 Qiagen Plasmid Midi Kit（Qiagen公司，德國）抽提質(zhì)粒。用Hin d III和Eco RI內(nèi)切酶對提取到的質(zhì)粒進行消化后判斷質(zhì)粒大小，酶切操作參照以上兩種內(nèi)切酶的使用說明書。采用Roche Dig Kit（Roche公司，美國），用blaKPC?2基因特異探針與質(zhì)粒酶切產(chǎn)物進行Southern雜交，具體操作參照試劑盒說明書進行。接合和轉(zhuǎn)化試驗的具體操作方法參照文獻［9，20］。

1．2．4 基因環(huán)境分析 用blaKPC?2基因引物對目的細菌基因組DNA進行基因擴增。擴增產(chǎn)物純化后送博尚生物公司測序，測序結果經(jīng)http：／／blast．ncbi．nlm．nih．gov／Blast比對，獲得KPC的基因環(huán)境。

2 結果與分析

2．1 KPC陽性菌株篩選及藥敏試驗

通過PCR篩選及測序確認，286株碳青霉烯類抗生素敏感性下降的革蘭陰性菌中有40株（占14%）攜帶有blaKPC?2基因，其中2株為植生拉烏爾菌，定名為RP1和RP2。經(jīng)臨床病歷分析，這兩株細菌均為腸道定植菌。

對分離得到的2株植生拉烏爾菌進行常見藥物耐藥性分析，發(fā)現(xiàn)這兩株菌均為產(chǎn)ESBLs的泛耐藥菌株，除對多粘菌素B、粘菌素敏感，對米諾環(huán)素中度敏感外，對其他16種被檢抗菌藥物均耐受。對三代、四代頭孢菌素和抗菌活性最強的碳青霉烯類抗菌藥物均耐受。替加環(huán)素是治療碳青霉烯類抗菌藥物耐藥細菌的常用藥物，這2株細菌也對此藥物耐受（見表1）。

表1 產(chǎn)KPC植生拉烏爾菌對19種抗菌藥物的MIC值Table 1 MIC values of 19 antibiotics for the KPC?producing Raoultella planticola．

2．2 基因定位

本文通過接合試驗、轉(zhuǎn)化試驗及Southern雜交判斷 blaKPC-2基因位于質(zhì)粒還是染色體上。Southern雜交顯示blaKPC?2基因特異探針能和提取自原始菌株和轉(zhuǎn)化陽性克隆并經(jīng) Hin dⅢ和Eco RⅠ內(nèi)切酶消化后的質(zhì)粒條帶雜交顯色，表明該基因位于質(zhì)粒上，結果見圖1。采用接合試驗得到了含blaKPC?2基因的接合子，轉(zhuǎn)化試驗也得到了含 blaKPC?2基因的陽性克隆，進一步證明了blaKPC?2基因位于質(zhì)粒上。

2．3 基因環(huán)境研究

2株細菌均獲得長度為7 498 bp的blaKPC?2基因及周圍序列，其所包含的結構從上游至下游分別 為 Tn3?transposase、Tn3?resolvase、 IS Kpn8、blaKPC?2和 IS Kpn6?like元件，見圖2。該結構以轉(zhuǎn)座子Tn3為基礎并整合了在美國、哥倫比亞及希臘等地廣泛流行的被認為是blaKPC?2起源的轉(zhuǎn)座子Tn4401的部分基因原件［21］，和 Shen等［18］首次報道的在中國流行的含KPC酶編碼基因的質(zhì)粒pKP048中的blaKPC?2周圍結構相一致。

圖1 blaKPC?2基因的定位Fig．1 Location of blaKPC?2gene．

圖2 攜帶blaKPC?2基因的轉(zhuǎn)座子結構Fig．2 Structure of transposes harbouring blaKPC?2gene．

3 討論

中國是碳青霉烯類KPC型耐藥流行區(qū)，目前主要分布在浙江、上海、江蘇、安徽及河南等9個省市［22］。浙江大學醫(yī)學院是我國首次發(fā)現(xiàn)KPC酶的醫(yī)院［9］，因此我們對院感最易發(fā)生的ICU病房進行主動監(jiān)測，留取了我院ICU病房住院病人的糞便／直腸拭子標本，篩查產(chǎn)KPC酶的革蘭陰性菌，分離得到40株產(chǎn)KPC的菌株，其中產(chǎn)KPC的銅綠假單胞菌和植生拉烏爾菌都是首次在中國被發(fā)現(xiàn)［23］。拉烏爾菌屬以前被認為是克雷伯菌屬的成員，后來才從克雷伯菌屬中獨立出來。因此2株初次鑒定為克雷伯菌的陽性菌株，后來根據(jù)16S rRNA基因才被鑒定為拉烏爾菌。拉烏爾菌的致病性和感染所致的臨床癥狀和克雷伯菌相似。

美國報道的2株植生拉烏爾菌分別分離自新澤西州和俄亥俄州。前者攜帶blaKPC?3基因，位于質(zhì)粒攜帶的轉(zhuǎn)座子Tn4401c上；后者攜帶blaKPC?2基因，位于染色體包含的轉(zhuǎn)座子Tn4401b上［17］。本文發(fā)現(xiàn)的2株碳青霉烯類耐藥的植生拉烏爾所產(chǎn)的KPC酶編碼基因均為blaKPC?2，目前我國發(fā)現(xiàn)的所有KPC編碼基因均為blaKPC?2。本研究結果顯示這2株細菌攜帶的blaKPC?2的周圍結構和中國流行的質(zhì)粒pKP048所攜帶的blaKPC?2周圍結構相一致。

本文分離的2株產(chǎn)KPC酶的植生拉烏爾菌均為多藥耐受，對當前臨床常用的抗菌藥物均耐受，一旦感染此菌治療非常棘手，因此監(jiān)護室應對攜帶這2株細菌的病人進行隔離。這2株細菌均從糞便標本中分離，因此醫(yī)護人員除了按院感規(guī)定進行操作外，還要注意對其大便處理程序進行嚴格控制以阻斷此細菌的蔓延。

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Genetic Environment of blaKPC?2in the Intestinal Colonized Raoultella planticolas

GE Chao?rong
First Affiliated Hospital，College ofMedicine，Zhejiang University，Hangzhou 310003，China

The increasing emergence and spread of Klebsiella pneumoniae carbapenemases（KPCs）leaves fewer available therapeutic options due to their broad?spectrum hydrolytic activity．Two KPC?2?producing Raoultella planticola isolates were first identified and analyzed using PCR，Southern hybridization and sequencing in China．Two isolates had an identical antimicrobial susceptibility profile，blaKPC?2gene aswell as its flanking sequences．They were resistant to 16 antimicrobial agentswhile sensitive to polymyxin B，colistin and minocycline．The results demonstrated that the blaKPC?2gene was located on a 7 498 bp plasmid segment that encoded five open reading frames with the order of Tn3?transposase，Tn3?resolvase，IS Kpn8，blaKPC?2gene and IS Kpn6?like．

Raoultella planticola；carbapenemase；plasmid

10．3969／j．issn．2095?2341．2013．05．10

2013?07?19；接受日期：2013?08?22

國家自然科學基金項目（81101283）資助。

葛超榮，副主任技師，主要從事醫(yī)學微生物研究。E?mail：gechaorong＠126．com