鄒 昕

福建省微生物研究所，福州350007

噴司他丁發(fā)酵條件的優(yōu)化

鄒 昕

福建省微生物研究所，福州350007

噴司他丁是一種抗腫瘤藥物，主要以微生物發(fā)酵法生產(chǎn)。本研究對噴司他丁發(fā)酵的通氣量、培養(yǎng)溫度、接種量、種齡、發(fā)酵周期等參數(shù)進行單因素考察，并通過正交試驗確定了噴司他丁最佳發(fā)酵參數(shù)為：裝量60 mL，種齡42 h，按5%接種量，28℃下發(fā)酵168 h，噴司他丁發(fā)酵效價達183μg／mL，比對照提高20%以上。

噴司他??；發(fā)酵；工藝；正交試驗

噴司他?。╬entostatin）是 1974年 Warner?Lambert等［1］從 土 壤 微 生 物 Streptomyces antibioticus中分離得到的一種擬嘌呤類的抗腫瘤藥，為白色結(jié)晶。該藥物于1992年首先在美國上市，1998年2月美國FDA正式批準注射粉針制劑噴司他丁上市。噴司他丁可用于治療干細胞白血病、慢性淋細胞白血病和覃樣霉菌病等，其作用機制為：通過抑制人體內(nèi)的腺苷脫氨酶（ADA）活性，使腫瘤細胞大量積累脫氧腺苷和5′?三磷酸脫氧腺苷（dATP），從而抑制DNA或RNA的合成，最終導致腫瘤細胞的死亡［2］。近年來的研究表明，噴司他丁不僅是有效的抗腫瘤藥物，而且可能是很有前途的免疫抑制劑［3］。如采用噴司他丁與Rituximab聯(lián)合應用治療低度惡性B細胞淋巴瘤，初步結(jié)果顯示其有效率（CR＋PR）達70%，尚有15%患者穩(wěn)定（SD），且患者容易耐受［4］。美國研究人員還發(fā)現(xiàn)采用噴司他丁結(jié)合紫外線治療有助于腫瘤病人骨髓移植［4］。美國SuperGen公司最近宣布，臨床研究顯示，噴司他丁可以有效治療兒童慢性移植物抗宿主?。╟GVHD），由于療效顯著目前在市場運用越來越廣泛，目前對其適應癥的研究還在不斷進行［5，6］。

目前已報到的噴司他丁的制備方法有兩種，微生物發(fā)酵法和化學合成法［7］。兩種制備方法各有優(yōu)劣，但以微生物發(fā)酵法更為經(jīng)濟，現(xiàn)階段國內(nèi)以微生物發(fā)酵法為主。微生物發(fā)酵法產(chǎn)量的高低不僅取決于菌株的單位水平、培養(yǎng)基的組成，還與發(fā)酵的培養(yǎng)條件有很大的關(guān)系［8～12］。本文在對噴司他丁微生物發(fā)酵的溫度、裝量、接種量、種齡、發(fā)酵周期的單因素研究基礎(chǔ)上，采用正交實驗來獲取最佳的培養(yǎng)條件，減少實驗次數(shù)，提高工藝優(yōu)化的效率，最終提高了噴司他丁的發(fā)酵產(chǎn)量。

1 材料和方法

1．1 菌種和培養(yǎng)基

噴司他丁產(chǎn)生菌（Streptomyces antiboticus）FIM06?063，由福建省微生物研究所提供。

1．2 培養(yǎng)基［13，14］

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖10 g／L，酪蛋白3 g／L，酵母粉3 g／L，瓊脂15 g／L。使用茄子瓶分裝培養(yǎng)基，121℃蒸汽滅菌30 min，滅菌后將茄子瓶傾斜擺放，制成斜面。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖10 g／L，酪蛋白3 g／L，酵母粉3 g／L。分裝于500mL三角瓶中，121℃蒸汽滅菌30 min備用。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖3 g／L，黃豆粉35 g／L，酵母粉2．5 g／L，碳酸鈣3．5 g／L，棉子油7．5 g／L。分裝于500 mL三角瓶中，121℃蒸汽滅菌30 min備用。

1．3 噴司他丁產(chǎn)生菌的發(fā)酵

在無菌操作環(huán)境下，用無菌不銹鋼勺從噴司他丁沙土管中取少許沙土，涂布在空白茄子瓶斜面上，涂抹時要均勻，使其生長一致，塞好棉塞。斜面于28℃培養(yǎng)15 h。取生長良好的茄子瓶菌種斜面，用接種針刮取斜面上的孢子至搖瓶種子瓶中，每瓶的孢子刮取面積約為1 cm2，搖瓶培養(yǎng)一定的時間后再接入發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中搖瓶培養(yǎng)。搖瓶的基本發(fā)酵條件為：28℃、200 r／min搖床振蕩培養(yǎng)，每瓶裝60 mL培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)54 h，發(fā)酵接種量為5mL／60mL（7．7%），發(fā)酵周期144 h。

1．4 發(fā)酵條件的優(yōu)化

1．4．1 單因素考察 分別考察溫度、裝量、接種量、種齡和發(fā)酵周期5個不同因素對發(fā)酵的結(jié)果影響［15～17］。溫度設(shè)置 24℃、26℃、28℃、30℃和32℃共5個處理，考察溫度對發(fā)酵的影響。裝量不同對應不同通氣量水平，在500 mL三角瓶中分別加入30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL、100 mL、110 mL和120 mL發(fā)酵液進行培養(yǎng)，獲得最佳裝量水平。接種量考察了1mL／60mL（1．6%）、2mL／60mL（3．2%）、3mL／60mL（4．8%）、 4mL／60mL （6．2%）、 5mL／60mL（7．7%）、7．5mL／60mL （11%）、10mL／60mL（14%）和12mL／60mL（17%）共8個不同水平，確定最佳接種量。種齡試驗分別選用36 h、42 h、48 h、54 h、60 h、66 h、72 h和78h共8個處理進行試驗，考察種子培養(yǎng)時間對發(fā)酵效價的影響。發(fā)酵周期試驗分別在48 h、60 h、72 h、84 h、96 h、108 h、120 h、132 h、144 h、156 h、168 h、180 h、192 h、204 h和216 h時取樣進行效價考察，由此確定最佳發(fā)酵周期。

1．4．2 正交實驗 在28℃條件下，對裝量、種齡、接種量、發(fā)酵周期4因素，取單因素實驗中最佳3種結(jié)果為不同水平，進行L9（34）正交試驗，進行噴司他丁發(fā)酵效價檢測［18］，確定最佳發(fā)酵參數(shù)。

1．5 發(fā)酵效價的測定

采用高效液相色譜法（HPLC）測定發(fā)酵液中噴司他丁的效價。

1．5．1 樣品制備 取10 mL發(fā)酵液，用中速定性濾紙初濾后吸取1mL濾液于50mL容量瓶中，加流動相定容，混勻，用0．45μm膜過濾，濾液即為HPLC測定樣品［19，20］。

1．5．2 HPLC測定條件 實驗采用島津公司產(chǎn)10AVp型高效液相色譜儀，色譜柱為250 mm× 4．6 mm，5μm，C8色譜柱（Phenomenex公司），預柱為4 mm×3．0 mm，C8色譜柱（Phenomenex公司）。精密吸取樣品溶液10μL注入高效液相色譜儀，柱溫20℃，流動相為：磷酸氫二銨∶甲醇∶乙腈＝950∶25∶25［21，22］，流速為1．0 mL／min，紫外282 nm和270 nm雙波長檢測。

1．5．3 標準曲線的制作 將噴司他丁標準譜系列稀釋后進行 HPLC測定，制作標準曲線，見圖1。

圖1 噴司他丁HPLC標準曲線Fig．1 Pentostatin HPLC standard curve．

1．5．4 樣品的測定 發(fā)酵液樣品進行HPLC測定，記錄色譜圖，噴司他丁的保留時間為8．5 min左右，按面積歸一法，根據(jù)標準曲線，計算發(fā)酵液中噴司他丁的效價，發(fā)酵液HPLC色譜圖見圖2。

2 結(jié)果與分析

2．1 最佳溫度的選擇

比較不同溫度條件下噴司他丁發(fā)酵的情況，設(shè)置24℃、26℃、28℃、30℃和32℃共5種溫度條件，其他培養(yǎng)條件不變實驗結(jié)果見圖3。溫度對效價的影響明顯，在24℃～26℃區(qū)間，效價增長明顯，28℃時達到最大。溫度超過30℃后效價迅速下降?？沙醪酱_定26～28℃溫度區(qū)間是噴司他丁產(chǎn)生菌的最適發(fā)酵溫度區(qū)間。

2．2 最佳通氣量的選擇

噴司他丁產(chǎn)生菌（菌種名稱）為好氧微生物，菌體在自身生長、繁殖及合成次級代謝產(chǎn)物的過程中都需要一定量氧氣。發(fā)酵罐上可以通過調(diào)節(jié)空氣流量和不同的攪拌轉(zhuǎn)速來控制通氣量［23］，實驗室搖瓶發(fā)酵則通過控制搖床轉(zhuǎn)速和改變搖瓶裝液量來模擬不同的通氣量。在其他基本發(fā)酵條件不變的情況下，分別在500 mL三角瓶中加入30～120 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，在固定轉(zhuǎn)速200 r／min的搖床上進行培養(yǎng)，考察通氣量對發(fā)酵效價影響，實驗結(jié)果見圖4。裝量在30～60mL時，效價曲線比較平穩(wěn)，呈現(xiàn)一個上升趨勢，當裝量超過60mL后下降趨勢明顯?？梢姡瑖娝舅‘a(chǎn)生菌的發(fā)酵對通氣量有一定需求，但通氣量并非越高越好，過大會造成菌絲早衰而斷裂成碎片，發(fā)酵提前終止的現(xiàn)象。因此60 mL是比較適合的裝量。

圖2 噴司他丁發(fā)酵液HPLC色譜圖Fig．2 HPLC chromatograms of pentostatin fermention broth．

圖3 溫度對噴司他丁發(fā)酵的影響Fig．3 Effect of temperature on pentostatin fermentation．

圖4 通氣量對噴司他丁發(fā)酵的影響Fig．4 Effect of ventilation on pentostatin fermentation．

2．3 最佳接種量的選擇

在發(fā)酵過程中，接種量影響發(fā)酵液中的菌濃度。將噴司他丁種子液按不同接種量（1．6%～17%）接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，考察接種量對發(fā)酵的影響，實驗結(jié)果見圖5。當接種量為1．6%～4．8%時，效價平穩(wěn)增加，接種量超過4．8%后，效價逐步下降，初步確定3mL／60mL（4．8%）為最佳的接種量。

圖5 接種量對噴司他丁發(fā)酵的影響Fig．5 Effect of inoculum volume on pentostatin fermentation．

2．4 最佳種齡的選擇

種齡過長或過短都將直接影響發(fā)酵水平。種齡過長會引起菌體過早自溶，導致產(chǎn)物生產(chǎn)能力下降；種齡過短，會造成發(fā)酵菌絲生長緩慢，發(fā)酵周期延遲，增加動力消耗。噴司他丁的種齡試驗分別選用36～78 h的種子進行試驗，在其他發(fā)酵條件不變的情況下，考察種子培養(yǎng)時間對發(fā)酵的影響，實驗結(jié)果見圖6。由圖6可以看出，噴司他丁種子液培養(yǎng)42 h可獲得最高效價，初步確定42 h為最佳的種齡。

圖6 種齡對噴司他丁發(fā)酵的影響Fig．6 Effect of seed age on pentostatin fermentation．

2．5 最佳發(fā)酵周期的選擇

最佳發(fā)酵周期的確定就是選擇發(fā)酵罐放罐的最佳時機。一般認為發(fā)酵周期的確定有三個原則：發(fā)酵目標產(chǎn)物的最大化；發(fā)酵成本的最低；對后續(xù)提取最有利。噴司他丁最佳發(fā)酵周期試驗選擇48～216 h中取樣檢測噴司他丁的發(fā)酵效價，實驗結(jié)果見圖7。可以看出，發(fā)酵周期在168 h時效價最高，之后效價后迅速下降，說明產(chǎn)物的分解也非常迅速。所以，168 h可做為最佳發(fā)酵周期。在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中，最佳發(fā)酵周期除了考慮獲取最高效價外還需考慮到對發(fā)酵液后續(xù)提取最有利和最低發(fā)酵成本等因素，還需根據(jù)具體情況調(diào)整。

圖7 發(fā)酵周期對噴司他丁發(fā)酵的影響Fig．7 Effect of time on pentostatin fermentation．

2．6 發(fā)酵工藝的正交試驗

正交試驗是基于數(shù)理統(tǒng)計學原理科學合理的安排實驗，并按一定規(guī)律分析處理實驗結(jié)果，從而能較快的找到工藝的最佳條件，且具有可判斷諸多因素中何種因素是主要因素，以及判斷影響因素之間的相互影響情況等優(yōu)點。根據(jù)單因素實驗結(jié)果，設(shè)置L9（34）正交試驗，溫度選擇28℃，考察的四因素為裝量、種齡、接種量和發(fā)酵周期，各因素選擇三水平，見表1，正交實驗結(jié)果見表2和表3。

表1 正交試驗的水平和因素Table 1 Levels and factors orthogonal test．

從表2中的數(shù)據(jù)結(jié)果可以看出，極差值RC＞RA＞RB＞RD，由此可見對噴司他丁效價影響最大的因素是接種量，其次是裝量（通氣量），再次是種齡和發(fā)酵周期。比較K值，最佳組合為A2B2C2D3，即裝量60 mL，種齡42 h，接種量5%，發(fā)酵周期168 h。由表3方差分析可知，接種量是影響噴司他丁發(fā)酵效價的極顯著因素，另外裝量是影響噴司他丁發(fā)酵效價的顯著因素，而種齡和發(fā)酵周期對噴司他丁發(fā)酵影響不顯著。極差和方差分析結(jié)果相互映證。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment．

表3 正交試驗方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment．

2．7 噴司他丁的發(fā)酵

按最佳條件進行發(fā)酵工藝驗證試驗，試驗重復3次，噴司他丁效價測定結(jié)果見表4。在未改進發(fā)酵條件下的噴司他丁對照組效價為151（μg／mL），優(yōu)化后發(fā)酵條件后噴司他丁效價為183（μg／mL），比對照組提高了20%以上。

表4 噴司他丁優(yōu)化發(fā)酵工藝驗證實驗結(jié)果Table 4 Pentostatin fermentation result after optimization of fermentiation process．

3 討論

pH、溫度、裝量、接種量、種齡和發(fā)酵周期等是發(fā)酵過程中的重要參數(shù)，對產(chǎn)物效價有直接影響。本研究未考察pH的影響，對其他因素逐一進行了單因素實驗考察，發(fā)現(xiàn)最佳溫度為28℃，最佳裝量為60 mL，最佳接種量為4．8%，最佳種齡為42 h，發(fā)酵周期為168 h。通過運用L9（34）正交試驗進一步確定了噴司他丁最佳發(fā)酵條件，優(yōu)化條件下，噴司他丁的效價達183μg／mL，比未優(yōu)化前提高了20%，有助于進一步擴大實驗規(guī)模，進入中試生產(chǎn)，為噴司他丁的生產(chǎn)應用積累數(shù)據(jù)資料。

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Optim ization of Pentostatin Fermentation Conditions

ZOU Xin
Fujian Institute ofMicrobiology，F(xiàn)uzhou 350007，China

Pentostatin is an anticancer drug，mainly produced by microbial fermentation．In this study，fermentation ventilation，temperature，inoculum，seed age，and other parameters of the fermentation cycle were discussed，then a orthogonal experiment was done to determine the optimum fermentation parameters：loading volume of60mL，seed age of42 h，5%inoculum，28℃for 168 h fermentation，pentostatin fermentation titer reached 183μg／mL，which was increased by 20%compared to the control．

pentostatin；fermentation；technology；orthogonal experiment

10．3969／j．issn．2095?2341．2013．05．12

2013?05?22；接受日期：2013?08?22

鄒昕，工程師，研究方向為免疫抑制劑微生物發(fā)酵。E?mail：fjfzzouxin＠126．com