劉迎輝，林海紅，杜鋼軍

（河南大學(xué)藥學(xué)院 藥物研究所，河南 開封 475004）

化療在腫瘤治療中一直占重要地位，而化療對(duì)機(jī)體自身的毒性和腫瘤耐藥是化療失敗的主要原因［1］。中藥可作用于腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)，在改善腫瘤患者體質(zhì)、降低化療藥物毒性、增強(qiáng)化療藥物的療效方面獨(dú)具特色［2］。

馬錢子以番木鱉之名始載于《本草綱目》，為辛溫大毒之品，具有通絡(luò)止痛、散結(jié)消腫之功效［3］。藥理實(shí)驗(yàn)［4］證明，馬錢子有較好的抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、抗血栓、抗心律失常等作用。復(fù)方馬錢子是一種復(fù)方中藥，其中的有效成分能對(duì)抗馬錢子中士的寧的驚厥作用，提高療效，改善患者的生活質(zhì)量。

實(shí)驗(yàn)采用小鼠H22肝癌皮下移植腫瘤模型，研究復(fù)方馬錢子的抗腫瘤作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物與瘤株

C57BL／6小鼠和昆明鼠，體質(zhì)量18～25g，河南省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；HCT－116 大腸癌細(xì)胞、H22肝癌細(xì)胞，由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。

1.2 藥品與試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基、MTT、胎牛血清（Sigma公司）；青霉素和鏈霉素（華北制藥集團(tuán)公司產(chǎn)品）；Na＋檢測(cè)試劑盒、K＋檢測(cè)試劑盒、Cl－檢測(cè)試劑盒、葡萄糖檢測(cè)試劑盒（上海榮盛生物藥業(yè)有限公司）。

1.3 復(fù)方馬錢子的制備

取10g復(fù)方馬錢子藥粉，用含體積分?jǐn)?shù)為52%乙醇的高粱酒500mL浸泡1周，過濾得到藥酒。加熱揮發(fā)酒精至100mL，加蒸餾水重新至500mL用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 儀器

ELX 800UV型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio－Tek公司）；SB－3C－1A型潔凈工作臺(tái)（100級(jí)潔凈等級(jí)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；XD－1014 倒置生物顯微鏡（南京江南光電集團(tuán)股份有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（NAPCO 公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 復(fù)方馬錢子對(duì)荷瘤小鼠體質(zhì)量、腫瘤及免疫器官的影響

取生長(zhǎng)良好的荷H22肝癌的昆明鼠處死，抽取其腹水，加無菌生理鹽水稀釋10倍，于小鼠前肢右腋皮下接種0.2mL／只，建立肝癌模型［5］。隨機(jī)分為2組，每組10 只。對(duì)照組：口服灌胃生理鹽水0.2mL／10g；給藥組：口服灌胃復(fù)方馬錢子提取液0.2mL／10g。腫瘤接種后當(dāng)日開始給藥，給藥1次／d，療程13d。治療后1次／d測(cè)量小鼠體質(zhì)量，待腫瘤長(zhǎng)出后用游標(biāo)卡尺隔天測(cè)腫瘤直徑1次，腫瘤大小按下列公式計(jì)算。

腫瘤體積（mm3）＝腫瘤長(zhǎng)度×腫瘤寬度×腫瘤寬度／2。

全程治療結(jié)束后，次日處死小鼠，剝離腋部腫瘤、脾臟、胸腺并稱重，計(jì)算腫瘤抑制率及臟器指數(shù)。

抑瘤率＝（1－T／C）×100%。式中：C為對(duì)照組平均瘤重（g）；T為實(shí)驗(yàn)組平均瘤重（g）。

臟器指數(shù)＝內(nèi)臟器官質(zhì)量（mg）／體質(zhì)量（g）。

2.2 復(fù)方馬錢子對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響［6］

將C57BL／6小鼠脫頸處死，無菌取出脾臟，置平皿中，加D－Hank，s 液，將其研磨成細(xì)胞勻漿。以Tris－NH4Cl溶液溶解紅細(xì)胞后，用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液（內(nèi)含青霉素和鏈霉素各100U／mL）調(diào)成2×106個(gè)／mL，接種于96孔板，100μL／孔。補(bǔ)充含不同濃度（濃度梯度分別為1、2、4g／L）復(fù)方馬錢子的培養(yǎng)基100μL／孔，每組4個(gè)復(fù)孔。置于體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37°C培 養(yǎng)48h，加5g／L的MTT溶液（PBS配置）100μL／孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h，加MDSO 100μL／孔，于酶標(biāo)儀490nm 測(cè)吸光度。計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)和促進(jìn)率，討論復(fù)方馬錢子對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響。

細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)＝A（加藥組）／A（對(duì)照組）×100%。

促進(jìn)率＝［（OD 加藥組－OD 對(duì)照組）／OD 加藥組］×100%

2.3 復(fù)方馬錢子對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響

將HCT－116大腸癌細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液（內(nèi)含青霉素和鏈霉素100U／mL）調(diào)成2×106個(gè)／mL，接種于96孔板，100μL／孔。加含不同濃度（濃度梯度分別為1、2、4g／L）復(fù)方馬錢子的培養(yǎng)基100μL／孔，每組4個(gè)復(fù)孔。置于體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37°C 培養(yǎng)48h，加5g／L MTT溶液（PBS配置），100μL／孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h，加MDSO，100μL／孔，于酶標(biāo)儀490nm 測(cè)吸光度，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)和生長(zhǎng)抑制率，討論復(fù)方馬錢子對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響。

細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)＝A（加藥組）／A（對(duì)照組）×100%。

抑制率＝［（OD 對(duì)照組－OD 加藥組）／OD 對(duì)照組］×100%。

2.4 復(fù)方馬錢子對(duì)荷瘤小鼠體內(nèi)離子、葡萄糖的影響

小鼠接種、分組及給藥方案同“2.1”。全程治療結(jié)束后，于次日小鼠眶靜脈取血，分離血清，－20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.1 血清中Na＋含量的測(cè)定 用Na＋試劑盒測(cè)定，采用比濁法，測(cè)定原理為：在分散劑和除干擾劑的存在下，Na＋與6－氫氧化銻鉀在分散劑的存在下與Na＋形成均一的濁度。在630nm 波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值，計(jì)算其含量。

鈉離子含量（mmol／L）＝測(cè)定管吸光度／標(biāo)準(zhǔn)管吸光度×標(biāo)準(zhǔn)管濃度。

2.4.2 血清中K＋含量的測(cè)定 用K＋試劑盒測(cè)定，采用比濁法，其原理為：在堿性介質(zhì)中，經(jīng)蛋白沉淀劑處理后的血清樣本中的K＋與NA－TPB 反應(yīng)產(chǎn)生渾濁并有穩(wěn)定的懸浮液。渾濁度與樣本中K＋濃度成正比。在440nm 波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值，計(jì)算其含量。

鉀離子含量（mmol／L）＝測(cè)定管吸光度／標(biāo)準(zhǔn)管吸光度×標(biāo)準(zhǔn)管濃度×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)（10）。

2.4.3 血清中Cl－含量的測(cè)定 用Cl－試劑盒測(cè)定，采用比濁法，其原理為：用硫氰酸汞處理Cl－形成有色絡(luò)合物，顏色深度與Cl－濃度呈正比。在480nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值，計(jì)算其含量。

氯離子含量（mmol／L）＝測(cè)定管吸光度／標(biāo)準(zhǔn)管吸光度×標(biāo)準(zhǔn)管濃度。

2.4.4 血清中葡萄糖含量的測(cè)定 用葡萄糖試劑盒測(cè)定，采用葡萄糖氧化酶－過氧化物酶法。其原理為：樣品中的葡萄糖經(jīng)葡萄糖氧化酶作用生成葡萄糖酸和過氧化氫，后者在過氧化物酶作用下，將還原性4－氨基安替吡啉與酚偶聯(lián)縮合成可被分光光度計(jì)測(cè)定的醌類化合物。在波長(zhǎng)520nm 處以磷酸鹽緩沖液替代血樣空白反應(yīng)管調(diào)零，讀取標(biāo)準(zhǔn)管和樣品管的吸光度值，計(jì)算其含量。

葡萄糖含量（mmol／L）＝樣本管吸光度／標(biāo)準(zhǔn)管吸光度×標(biāo)準(zhǔn)管濃度。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Excel進(jìn)行組間單因素方差分析。計(jì)算資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示顯著性差異，P＜0.01表示非常顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)荷瘤小鼠體質(zhì)量、腫瘤及免疫器官的影響

3.1.1 對(duì)荷瘤小鼠體質(zhì)量的影響與對(duì)照組小鼠相比較，復(fù)方馬錢子給藥組的小鼠體質(zhì)量呈明顯下降趨勢(shì)，見圖1。

3.1.2 對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響與對(duì)照組小鼠相比較，復(fù)方馬錢子對(duì)腫瘤有明顯的抑制作用，抑瘤率為61.75%，見圖2、表1。

圖1 復(fù)方馬錢子對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

圖2 復(fù)方馬錢子對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響

表1 復(fù)方馬錢子對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響（，n＝10）

3.1.3 對(duì)荷瘤小鼠免疫器官指數(shù)的影響與對(duì)照組小鼠比較，復(fù)方馬錢子組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著下降，肝臟指數(shù)無明顯改變，見表2。

3.2 對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響

復(fù)方馬錢子對(duì)HCT－116大腸癌細(xì)胞成劑量依賴性抑制作用，對(duì)淋巴細(xì)胞增殖無明顯影響，見表3、表4。

表2 荷瘤小鼠免疫器官指數(shù)（，n＝10）

表3 復(fù)方馬錢子對(duì)HCT－116大腸癌細(xì)胞增殖的影響（，n＝6）

3.3 對(duì)荷瘤小鼠體內(nèi)離子的影響

與正常組（非荷瘤小鼠）相比，對(duì)照組小鼠血清中Na＋、Cl－含量降低（P＜0.01），K＋、Glu 含量升高（P＜0.01）。與對(duì)照組相比較，給藥組血清中K＋、Cl－、Glu含量升高，但Na＋改變不明顯，見表5。

表4 復(fù)方馬錢子對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響（，n＝6）

表5 復(fù)方馬錢子對(duì)荷瘤小鼠血清中Na＋、K＋、Cl－、Glu含量的影響（，n＝10）

4 討論

總生物堿是馬錢子中最主要的有效成分，目前的研究［7］表明，馬錢子總生物堿中至少有16 種生物堿成分，主要成分是士的寧和馬錢子堿，而士的寧過量中毒可引起肢體顫動(dòng)、驚厥、呼吸困難，甚至昏迷，嚴(yán)重的可危及生命［8］。實(shí)驗(yàn)中，給予0.2L／10g的復(fù)方馬錢子劑量，小鼠并未出現(xiàn)明顯的士的寧中毒癥狀，說明復(fù)方馬錢子中的成分能有效對(duì)抗士的寧所致的驚厥，降低毒副作用，提高患者的生活質(zhì)量。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，馬錢子不但有較好的抗腫瘤、抗轉(zhuǎn)移作用，還可明顯緩解患者臨床癥狀，改善生活質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期，提高機(jī)體免疫力，已成為抗腫瘤中藥研究的一個(gè)熱點(diǎn)［9］。實(shí)驗(yàn)研究［10］發(fā)現(xiàn)，復(fù)方馬錢子對(duì)腫瘤有顯著的抑制作用，抑瘤率為61.75%，惡性腫瘤的發(fā)生與機(jī)體的免疫力低下或缺失密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)中，小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均下降，說明復(fù)方馬錢子對(duì)免疫器官有抑制作用，而對(duì)肝臟毒性作用不明顯。

在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，離子通道的表達(dá)和活性發(fā)生改變，這種異常表達(dá)和活性改變又與腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡密切相關(guān)［11］。另外，葡萄糖的高消耗和逃避失常凋亡，也被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞的特征性改變。實(shí)驗(yàn)顯示，與正常組相比，荷瘤小鼠對(duì)照組血清中Na＋、Cl－含量顯著降低，K＋含量顯著升高，說明腫瘤的發(fā)生引起了機(jī)體電解質(zhì)紊亂；與對(duì)照組相比，復(fù)方馬錢子給藥組血清中的K＋、Cl－含量顯著增加，說明復(fù)方馬錢子可調(diào)節(jié)離子通道而使電解質(zhì)趨于正常，但具體機(jī)制尚不清楚，還需進(jìn)一步探討。荷瘤小鼠與正常組相比血清中葡萄糖含量升高，給藥組與對(duì)照組相比葡萄糖含量顯著下降，說明腫瘤的發(fā)生使機(jī)體代謝加強(qiáng)，而給藥后的作用調(diào)節(jié)使代謝趨于正常水平。

［1］Papazisis K T，Kalemi T G，Zambouli D，et al.Synergistic effects of protein tyrosine inhibitor genistein with camptothecins against three lines in vitro［J］.Caner Lett，2006，233（2）：255－264.

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