陳子華，王月靜，張莉

(遼寧醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001)

神經(jīng)病理性疼痛(Neuropathic Pain，NPP)是由于外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)的直接損傷和功能紊亂所引起的疼痛，其病理生理學(xué)特征主要表現(xiàn)為痛覺過敏、痛覺超敏和自發(fā)性疼痛。痛覺過敏是指對傷害性刺激產(chǎn)生過強(qiáng)的傷害性反應(yīng);痛覺超敏是指對非傷害性刺激產(chǎn)生傷害性反應(yīng);自發(fā)性疼痛是指在沒有可見的刺激條件下出現(xiàn)的疼痛［1］。感染、腫瘤、外傷和中風(fēng)等均能引起外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，從而引起疼痛和痛覺過敏等［2］。研究發(fā)現(xiàn)，鋅離子可能參與了NPP 的形成，因此，為了深入研究鋅參與NPP 的可能機(jī)制，本研究擬應(yīng)用小鼠足底注射辣椒素制備NPP 動物模型，應(yīng)用金屬自顯影技術(shù)和圖像分析技術(shù)對鋅預(yù)處理影響NPP 模型動物脊神經(jīng)節(jié)鋅離子分布變化進(jìn)行定性和半定量分析，從而為深入研究鋅參與NPP 發(fā)病機(jī)制提供基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組與模型制備

8 w 齡C57/BL6 小鼠24 只，雌雄各半，體重30～40 g，隨機(jī)分為4 組: (1)對照組(Con):正常喂養(yǎng)(鋅:30.0 mg/kg)2 w 后足底注射溶劑(吐溫80∶無水酒精∶生理鹽水=1∶1∶8 混合液);(2)N－NPP 組:正常喂養(yǎng)(鋅:30.0 mg/kg)2 w 后足底注射辣椒素(0.5%，5 μL); (3)L－NPP 組:低鋅喂養(yǎng)(鋅:0.85 mg/kg)2 w 后足底注射辣椒素(0.5%，5 μL); (4)H－ NPP 組:高鋅喂養(yǎng)(飲用硫酸鋅水溶液，227 mg/L)2 w 后足底注射辣椒素(0.5%，5 μL)。

1.2 標(biāo)本制備與金屬自顯影技術(shù)

術(shù)后7 d，各組小鼠腹腔注射硒酸鈉(20 mg/kg)，存活1.5 h 后將動物麻醉，2.5%的戊二醛經(jīng)心臟灌流固定，取腰5 節(jié)段脊神經(jīng)節(jié)。后固定3 h，30%蔗糖4 °C 過夜，恒冷切片機(jī)制備10 μm 厚冰凍切片。切片置于金屬自顯影孵育液(60 mL 阿拉伯膠、10 mL 檸檬酸緩沖液、15 mL 對二苯酚和15 mL 乳化銀)中，26 ℃震蕩水浴箱中孵育60 min。切片常規(guī)脫水、透明和封片，光鏡下進(jìn)行觀察。

1.3 圖像分析與統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 金屬自顯影染色結(jié)果

金屬自顯影染色陽性反應(yīng)產(chǎn)物為棕黑色顆粒，表明有鋅離子存在，主要分布在小鼠脊神經(jīng)節(jié)的細(xì)胞質(zhì)中。其中，對照組(Con 組)脊神經(jīng)節(jié)有中等量的陽性反應(yīng)產(chǎn)物。與Con 組相比較，H－NPP 組模型動物脊神經(jīng)節(jié)中的陽性反應(yīng)產(chǎn)物顯著增多;而N－NPP 組和L－NPP 組脊神經(jīng)節(jié)中的陽性反應(yīng)產(chǎn)物均顯著減少，其中，L－NPP 組脊神經(jīng)節(jié)中的陽性反應(yīng)產(chǎn)物分布最稀疏(圖1)。

2.2 圖像分析結(jié)果

圖像分析顯示，與對照組(Con 組)比較，H－NPP 組脊神經(jīng)節(jié)的陽性表達(dá)面積顯著增高，吸光度顯著降低(P ＜0.01);而N－NPP 組和L－NPP組脊神經(jīng)節(jié)的陽性表達(dá)面積均顯著降低，吸光度增高(P ＜0.01)。其中，L－NPP 組脊神經(jīng)節(jié)的陽性表達(dá)面積低于N－NPP 組，吸光度高于N－NPP 組(P ＜0.01，圖2－3)。

3 討 論

神經(jīng)病理性疼痛是由神經(jīng)損傷、炎癥和腫瘤等各種疾病引起的疼痛癥狀，表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛、痛閾下降(即，非傷害性刺激亦可引起疼痛)、痛反應(yīng)增強(qiáng)、持續(xù)時間較長等［3］。神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，包括中樞敏感化和外周敏感化兩大機(jī)制［4］，由于缺乏有效的治療手段，該疾病已經(jīng)嚴(yán)重影響了病人的生活質(zhì)量，使病人痛苦不堪，因此探索NPP 的發(fā)病機(jī)制從而尋找更有效的治療手段已成為現(xiàn)代神經(jīng)科學(xué)研究的重點(diǎn)。

鋅是人體內(nèi)300 多種酶和轉(zhuǎn)錄因子的重要組成成分，起著穩(wěn)定結(jié)構(gòu)、催化和調(diào)節(jié)的作用，直接參與了核酸和蛋白質(zhì)的合成、細(xì)胞的分化和增殖等，在維持機(jī)體的正常生理功能以及生長發(fā)育等過程中發(fā)揮著重要的作用［5］。近年來，人們利用金屬自顯影等技術(shù)發(fā)現(xiàn)在疼痛初級中樞 (脊髓)以及外周神經(jīng)(脊神經(jīng)節(jié)和頸上神經(jīng)節(jié))等有豐富的鋅離子［6－7］，這些鋅離子分布于神經(jīng)元的核周質(zhì)或者軸突終末，當(dāng)神經(jīng)沖動傳導(dǎo)到軸突終末時，這些鋅與神經(jīng)遞質(zhì)一起被釋放到突觸間隙內(nèi)，作用于突觸后膜的相應(yīng)受體，從而影響突觸后膜的興奮性活動，提示鋅離子可能與疼痛的產(chǎn)生與傳遞有關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)，在脊髓背側(cè)角和脊神經(jīng)節(jié)中存在著豐富的含鋅初級傳入神經(jīng)元［8－9］;脊神經(jīng)背根切斷術(shù)后，脊髓后角鋅離子減少，伴隨小鼠痛閾降低，推斷鋅可能參與了痛覺的傳導(dǎo)［10］。本研究中發(fā)現(xiàn)，在小鼠脊神經(jīng)節(jié)中存在豐富的鋅離子，當(dāng)足底注射辣椒素引起NPP時，脊神經(jīng)節(jié)中的鋅離子顯著減少，金屬自顯影陽性產(chǎn)物的表達(dá)面積減少，吸光度增加，分析出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是由于NPP 時，外周神經(jīng)興奮性增強(qiáng)，脊神經(jīng)節(jié)中的初級傳入神經(jīng)元在短時間內(nèi)向中樞釋放大量的活性物質(zhì)和鋅離子，因此使脊神經(jīng)節(jié)中的鋅離子迅速耗竭。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，高鋅預(yù)處理能改善NPP小鼠脊神經(jīng)節(jié)中的缺鋅狀況，使鋅離子增多、鋅陽性反應(yīng)產(chǎn)物增多、吸光度降低;而低鋅預(yù)處理能加重NPP 小鼠脊神經(jīng)節(jié)中的缺鋅狀況，鋅陽性反應(yīng)產(chǎn)物減少、吸光度增加，提示鋅預(yù)處理能影響NPP時脊神經(jīng)節(jié)中鋅的分布。以往的研究表明，NPP 時鋅離子顯著減少，給予鋅能降低動物的痛覺過敏，對NPP 有顯著的抑制作用［11］。那么，鋅預(yù)處理是否由于改變了鋅在神經(jīng)系統(tǒng)中的分布從而抑制了NPP 的產(chǎn)生與傳導(dǎo)，鋅在NPP 發(fā)病過程中到底有什么作用尚需要進(jìn)一步的研究。

圖1 金屬自顯影染色顯示鋅在各組模型動物脊神經(jīng)節(jié)的分布，×100

圖2 鋅在各組模型動物脊神經(jīng)節(jié)的陽性表達(dá)面積(，n=6)

圖3 各組模型動物脊神經(jīng)節(jié)中鋅分布的吸光度(，n=6)

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