于書記，姜鑫

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院外科學(xué)教研室;2.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬濰坊市人民醫(yī)院骨關(guān)節(jié)外科，山東 濰坊 261053)

近年來，大量行半月板部分或全部切除術(shù)的患者較早的出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)退變性骨關(guān)節(jié)炎［1－2］，預(yù)后很不樂觀，提示半月板在膝關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)負(fù)重、緩沖震蕩和維持穩(wěn)定等方面發(fā)揮著重要的生物力學(xué)功能、扮演著極其關(guān)鍵而特殊的角色［3－4］。因此現(xiàn)階段對(duì)于半月板損傷后修復(fù)的研究顯得尤其重要和必要!

實(shí)驗(yàn)研究［5－6］證實(shí)胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ(IGF－Ⅰ，Insulin－like growth factor I)對(duì)體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞等多種組織細(xì)胞有顯著的促增殖作用，且研究顯示Ⅰ型膠原具有良好的生物相容性，可作為組織損傷修復(fù)的支架材料，而目前用胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ/Ⅰ型膠原復(fù)合物(IGF－Ⅰ/Ⅰ型膠原復(fù)合物)修復(fù)半月板損傷的研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)旨在驗(yàn)證胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ/Ⅰ型膠原復(fù)合物對(duì)兔半月板無(wú)血運(yùn)區(qū)損傷的修復(fù)效果，為臨床半月板無(wú)血運(yùn)區(qū)損傷的修復(fù)探索新的途徑。

1 材料和方法

1.1 設(shè)計(jì)

隨機(jī)分組，對(duì)比觀察。

1.2 時(shí)間及地點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)于2011 年8 月至2012 年10 月在濰坊醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年新西蘭大白兔36 只，雌雄不限，體質(zhì)量2.2～2.8 kg，由濰坊醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置參照國(guó)家科學(xué)技術(shù)部2006 年發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》［7］。

1.4 實(shí)驗(yàn)材料

IGF－Ⅰ，Ⅰ型膠原溶液(武漢博士德生物工程有限公司);光鏡及HE 染色試劑由濰坊醫(yī)學(xué)院組織學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 IGF－Ⅰ/Ⅰ型膠原復(fù)合物的制備

既往研究表明體外培養(yǎng)半月板、軟骨等組織細(xì)胞時(shí)，IGF－Ⅰ在50 μg/L 濃度時(shí)具有最大促增殖效應(yīng)。用雙腔注射器抽取等量的質(zhì)量濃度為50 μg/L IGF－I 溶液和I 型膠原溶液制成復(fù)合物注射于治療部位。

1.5.2 動(dòng)物模型建立

將健康成年新西蘭大白兔36 只按隨機(jī)數(shù)字法均分為3 組，并于實(shí)驗(yàn)前8 小時(shí)禁食，自由飲水。用2.5%戊巴比妥鈉(2.5 mg/kg)于兔耳緣靜脈注射全麻;麻醉后仰臥位固定四肢，雙后肢膝部脫毛，常規(guī)碘酊、酒精消毒，鋪無(wú)菌巾。屈膝90°，取雙膝關(guān)節(jié)髕韌帶外側(cè)手術(shù)入路(防止術(shù)后尿液污染導(dǎo)致切口感染)約2 cm 弧形切口，沿髕骨外上緣至脛骨結(jié)節(jié)處切開皮膚及皮下各層，用自制的半月板拉鉤顯露外側(cè)半月板前角、體部及股骨髁軟骨面。參照相關(guān)文獻(xiàn)［8］，用鐮狀刀片于外側(cè)半月板游離緣體部造成一個(gè)長(zhǎng)0.7 cm、寬0.3 cm 的統(tǒng)一的無(wú)血運(yùn)區(qū)縱行全層裂傷模型。

1.5.3 隨機(jī)分組

空白對(duì)照組中半月板損傷區(qū)不作任何填塞處理，IGF－Ⅰ組半月板損傷區(qū)內(nèi)注射1 mL IGF－Ⅰ溶液(配制50 μg/L 的濃度);IGF－Ⅰ/Ⅰ型膠原組半月板損傷區(qū)注入胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ/Ⅰ型膠原復(fù)合物至填充劑與半月板表面相平為止。然后用3.0 尼龍線緊密縫合關(guān)節(jié)囊以防液體滲出，抗生素敷料包扎。

1.5.4 術(shù)后處理

術(shù)后每只兔每天肌注青霉素8 萬(wàn)單位，連續(xù)5 d，預(yù)防感染。自制小夾板固定膝部2 周，限制關(guān)節(jié)活動(dòng)。分籠飼養(yǎng)，連續(xù)觀察進(jìn)食、活動(dòng)、切口有無(wú)紅腫及滲液等情況。分別于術(shù)后第4、8、12 周，分批隨機(jī)選取3 組中各4 只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，從耳緣靜脈行空氣栓塞法處死，打開關(guān)節(jié)腔，切取半月板組織標(biāo)本并無(wú)菌保存。

1.5.5 觀察指標(biāo)

將半月板標(biāo)本進(jìn)行大體形態(tài)觀察后，置入體積分?jǐn)?shù)為10%甲醛溶液中固定2～3 d，再進(jìn)行脫水、浸蠟包埋處理，最后對(duì)切片采用蘇木精—伊紅染色，行光鏡下組織學(xué)檢查。

1.5.6 設(shè)計(jì)、實(shí)施、評(píng)估者

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、干預(yù)實(shí)施為第一作者，評(píng)估為第二作者;實(shí)驗(yàn)實(shí)施者接受正規(guī)培訓(xùn)，評(píng)估者采用盲法評(píng)估。

2 結(jié) 果

2.1 大體觀察

觀察3 組中36 只實(shí)驗(yàn)兔，手術(shù)后膝關(guān)節(jié)均無(wú)切口感染及關(guān)節(jié)積液，無(wú)半月板與關(guān)節(jié)面軟骨粘連;空白對(duì)照組及IGF－Ⅰ組半月板損傷區(qū)3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)均未愈合、未見組織填充(圖1)，IGF－Ⅰ/Ⅰ型膠原組的半月板裂口在第12 周時(shí)均已被組織填充;愈合組織的顏色較正常半月板組織深，裂口較術(shù)前變窄，其表面稍向內(nèi)陷，愈合組織與鄰近半月板組織粘連緊(圖2)。

2.2 組織學(xué)檢查

空白對(duì)照組:術(shù)后各觀察期裂口邊緣均無(wú)纖維軟骨細(xì)胞或成纖維細(xì)胞增殖。IGF－Ⅰ組:術(shù)后4 w，半月板邊緣滑膜細(xì)胞少量增生;術(shù)后8 w，半月板邊緣滑膜細(xì)胞顯著增生，半月板裂口未見愈合跡象;術(shù)后12 w，裂隙處仍無(wú)纖維軟骨細(xì)胞增殖，亦無(wú)同源細(xì)胞群出現(xiàn)。

IGF－Ⅰ/Ⅰ型膠原組:術(shù)后第4 周，鏡下見缺損處被膠質(zhì)樣組織充填，可見少量纖維組織與正常組織交織，裂隙兩邊有纖維軟骨細(xì)胞增殖表現(xiàn)，修復(fù)組織內(nèi)尚未見明顯纖維軟骨細(xì)胞(圖3);術(shù)后第8 周，鏡下見纖維樣組織形成，并與周圍正常組織相連，纖維排列不規(guī)則，可見散在的纖維軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)，無(wú)軟骨囊形成(圖4);術(shù)后第12 周，鏡下見整個(gè)缺損區(qū)均已被纖維軟骨樣組織填充，愈合組織內(nèi)見較多纖維軟骨細(xì)胞形成，部分可見軟骨囊或軟骨陷窩，膠原纖維排列較前規(guī)則，接近于正常的半月板組織(圖5)。另有少數(shù)標(biāo)本表現(xiàn)為瘢痕樣組織愈合，未見纖維軟骨細(xì)胞出現(xiàn)，纖維排列欠規(guī)則，愈合組織與正常半月板的組織學(xué)特征有明顯差異(圖6)。

3 討 論

3.1 半月板的生理分區(qū)及損傷的治療進(jìn)展

半月板在臨床上根據(jù)血運(yùn)供應(yīng)、承受機(jī)械應(yīng)力以及解剖部位不同一般被分為3 個(gè)區(qū):紅區(qū)、白區(qū)和紅一白區(qū)。紅區(qū)位于半月板滑膜緣，又稱有血運(yùn)區(qū);白區(qū)位于半月板游離緣，又稱無(wú)血運(yùn)區(qū);紅—白區(qū)為紅區(qū)向白區(qū)過渡部分，由紅區(qū)毛細(xì)血管終末支供血。既往研究表明［9］，無(wú)血運(yùn)區(qū)營(yíng)養(yǎng)主要來自滑液，損傷后不能自行修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)中空白對(duì)照組整個(gè)觀察期始終沒有愈合的反應(yīng)，與這一普遍結(jié)論是相符的，這可能與半月板游離緣大部分區(qū)域沒有血供缺乏營(yíng)養(yǎng)支持及半月板軟骨細(xì)胞自身的增殖惰性等多種因素有關(guān)。近年來半月板鉆孔建立血管通道［10］、凝血塊移植、滑膜移植等治療半月?lián)p傷均有大量研究，取得了一定程度的進(jìn)展。而當(dāng)前對(duì)組織工程半月板的研究成為熱點(diǎn)，其中以種子細(xì)胞［11］、支架材料和細(xì)胞因子的研究居多。本實(shí)驗(yàn)即研究以胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ與Ⅰ型膠原材料相結(jié)合修復(fù)兔半月板損傷的效果，結(jié)果顯示胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ在Ⅰ型膠原作為生物支架材料存在時(shí)可有效刺激活體兔半月板纖維軟骨細(xì)胞的增殖，IGF－Ⅰ/Ⅰ型膠原復(fù)合物對(duì)兔半月板無(wú)血運(yùn)區(qū)的損傷在一定程度上具有較好的修復(fù)作用，這為臨床半月板無(wú)血運(yùn)區(qū)損傷的修復(fù)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，提供了一種相對(duì)可行的參考方法。

3.2 GF－Ⅰ的生物特性及在半月板損傷愈合中的作用

研究表明［12］，IGF－Ⅰ對(duì)成骨細(xì)胞的增殖和分化及骨代謝的調(diào)節(jié)也有重要作用，是骨塑形改建過程中的重要調(diào)節(jié)因子，刺激成骨前體細(xì)胞增殖，促進(jìn)Ⅰ型膠原和骨基質(zhì)的合成，促進(jìn)骨的生長(zhǎng)和損傷的修復(fù)。經(jīng)研究證實(shí)［13］，IGF－Ⅰ是一種在體內(nèi)參與多種生理調(diào)節(jié)的多肽，可調(diào)節(jié)軟骨發(fā)育和軟骨自穩(wěn)態(tài)，刺激軟骨細(xì)胞分裂增殖，并促進(jìn)軟骨蛋白聚糖的合成，維持軟骨細(xì)胞的表型，促進(jìn)軟骨愈合。

后有研究表明［14］，IGF－Ⅰ可以明顯促進(jìn)立體培養(yǎng)的半月板纖維軟骨細(xì)胞的增殖，尤其對(duì)于無(wú)血運(yùn)區(qū)的細(xì)胞促增殖效果更顯著。本實(shí)驗(yàn)中，IGF－Ⅰ組只對(duì)半月板邊裂口緣滑膜細(xì)胞有促增殖作用，而對(duì)無(wú)血運(yùn)區(qū)損傷的愈合卻無(wú)明顯影響，這可能與胰島素樣因子單獨(dú)存在時(shí)由于缺少生物支架材料的保護(hù)更容易被降解、稀釋等原因有關(guān)，也可能是由于增生的細(xì)胞數(shù)量較少，新生的細(xì)胞缺少纖維蛋白支架的支撐而不能移行生長(zhǎng)，最終達(dá)不到愈合的目的。

3.3 Ⅰ型膠原在組織損傷愈合中的作用

Ⅰ型膠原是一種分布在骨、軟骨、肌腱、血管、皮膚等結(jié)締組織的含糖蛋白質(zhì)，作為天然的細(xì)胞外基質(zhì)，其結(jié)構(gòu)非常有利于培養(yǎng)中細(xì)胞的黏附、增殖和分化。Ⅰ型膠原為半月板基質(zhì)的主要成分，能有效促使半月板纖維軟骨細(xì)胞盡早黏附、維持表型、形成集落，并能刺激細(xì)胞分泌膠原等。研究結(jié)果［15］顯示:Ⅰ型膠原作為生長(zhǎng)因子緩釋載體和基因治療的載體，具有良好的生物相容性，在半月板、關(guān)節(jié)軟骨等結(jié)締組織損傷的修復(fù)中有著廣闊的前景。

3.4 IGF－Ⅰ/Ⅰ型膠原復(fù)合物在半月板損傷愈合中的作用

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IGF－ Ⅰ/Ⅰ型膠原復(fù)合物可增強(qiáng)IGF－Ⅰ的生物學(xué)活性，比單用IGF－Ⅰ的效果明顯要好，多數(shù)表現(xiàn)為纖維軟骨樣組織愈合。這提示半月板并非一定是完全惰性的組織，在適宜的條件刺激下，半月板無(wú)血運(yùn)區(qū)的損傷可產(chǎn)生纖維組織愈合。我們認(rèn)為:當(dāng)給予適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)環(huán)境，并有種子細(xì)胞、支架材料、生長(zhǎng)因子三者甚至更多因素的共同參與時(shí)，纖維軟骨細(xì)胞大量增殖及基質(zhì)蛋白充分合成等，半月板無(wú)血運(yùn)區(qū)損傷的愈合是可實(shí)現(xiàn)的。如果引入反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT－PCR)技術(shù)，可更加確切的證實(shí)愈合組織為半月板組織。

期待在后續(xù)研究中，進(jìn)一步引入種子細(xì)胞或更多種生長(zhǎng)因子，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)，進(jìn)行更深層次的探索，以期能獲得一種更理想的復(fù)合型組織工程材料，使半月板的損傷能在組織結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)功能上獲得雙重修復(fù)。

圖1 空白對(duì)照組及IGF－Ⅰ組未愈合

圖2 復(fù)合物組愈合且連接緊密

圖3 IGF－Ⅰ/Ⅰ型膠原組術(shù)后第4 周膠質(zhì)樣組織充填 HE×100

圖4 IGF－Ⅰ/Ⅰ型膠原組術(shù)后第8 周纖維樣組織填充 HE×100

圖5 IGF－Ⅰ/Ⅰ型膠原組術(shù)后第12 周纖維軟骨樣組織 HE×100

圖6 IGF－Ⅰ/Ⅰ型膠原組術(shù)后第12 周瘢痕樣組織愈合 HE×100

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