葉亞峻，朱小存，朱治淮，劉 琪，秦 凱

（淮安市腫瘤醫(yī)院普通外科，江蘇223200）

結(jié)直腸癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，目前居惡性腫瘤發(fā)病率第4位[1]。結(jié)腸癌的形成和發(fā)展是一個(gè)多步驟、多階段過(guò)程,這其中有多種癌基因、抑癌基因、凋亡基因的失活和抗凋亡基因激活及它們的相互促進(jìn)及拮抗作用。蛋白酪氨酸磷酸酶1B（protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B）是一種經(jīng)典非跨膜性蛋白酪氨酸磷酸酶，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起重要作用，并在許多生理調(diào)節(jié)過(guò)程中也起關(guān)鍵作用。有證據(jù)表明PTP1B與多種腫瘤具有相關(guān)性，PTP1B在食管癌、前列腺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤和卵巢癌等多種腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[2-3]。近來(lái)Zhu等[4]的研究證實(shí)在結(jié)腸癌細(xì)胞中，PTP1B的過(guò)度表達(dá)與c-Src中529位點(diǎn)殘基的磷酸化抑制能力降低相關(guān)，其結(jié)果導(dǎo)致軟瓊脂中集落的快速形成及裸鼠中腫瘤生長(zhǎng)加速，最終加速結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

本研究應(yīng)用RNAi技術(shù),體外篩選有效靶向人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞株P(guān)TP1B基因的干擾RNA(shRNAPTP1B)建立穩(wěn)定表達(dá)株,分析PTP1B1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和成瘤能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞株（中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心）。RT-PCR試劑盒（加拿大 Fermentas公司），Trizol，Lipofectamine 2000（美國(guó)Invitrogen公司），DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清，青霉素、鏈霉素（美國(guó)Gibco公司），兔抗人PTP1B單克隆抗體（美國(guó)Abcam公司），Western Blot試劑盒及細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)試劑盒(cck-8)（中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所）。BABL/c裸鼠12只（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），4～5周齡，均為雄性。PTP1B引物及內(nèi)參照引物GAPDH由上海吉?jiǎng)P公司設(shè)計(jì)并合成，靶向PTP1B的干擾質(zhì)粒及質(zhì)粒載體由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司協(xié)助設(shè)計(jì)構(gòu)建，載體含有編碼綠色熒光蛋白(GFP)及新霉素(Neo)的報(bào)告基因。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染：（1） 人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞，以含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37℃含有5%CO2的培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)。細(xì)胞基本鋪滿瓶底時(shí)傳代及進(jìn)行相關(guān)操作。（2）細(xì)胞轉(zhuǎn)染前1天，將人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞接種于6孔板，每孔4×105個(gè)細(xì)胞。加入2mL含10%血清的培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，待細(xì)胞匯合度在70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染（LoVo/shRNA）。每孔加入4μg質(zhì)粒加10μL轉(zhuǎn)染試劑，同時(shí)轉(zhuǎn)染空載體作為陰性對(duì)照（LoVo/negative），將培養(yǎng)基換成無(wú)血清培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后6h更換培養(yǎng)基。

1.2.2 RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后PTP1B mRNA表達(dá)變化：Trizol法提取細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度計(jì)定量，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-PCR擴(kuò)增。PTP1B基因的引物為Forward:5’-CTAAGG-ATCCAAGAAGCAGCAGCGGCTAGG-3Reverse:5’-CAGTGAATTCTGGAGGAGGGTCAGGCTATG-3。GAPDH 基因:5′-CTGCCCAGAACATCATCCCT-3′(forward),3′-TGAAGTCAGGAGACAACC-5′(reverse)。PCR 反應(yīng)條件為 95°C 2min 預(yù)變性，95°C 30s，57.4°C 30s，72°C 30s，共 35 個(gè)循環(huán)，72°C 10min延伸。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)光成像系統(tǒng)拍照，以PTP1B/GAPDH灰度值比值作為PTP1BmRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后 PTP1B 蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化:用細(xì)胞裂解液提取各組細(xì)胞的總蛋白，加熱變性后，聚丙烯酰胺凝膠 (SDSPAGE)電泳分離，電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉封閉2h，分別加入兔抗人PTP1B(1∶1 000)一抗，4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次10min后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶1 000)，室溫孵育 2h?；瘜W(xué)發(fā)光法(ECL)顯影。以 βactin作為內(nèi)參。

1.2.4 用CCK-8試劑盒檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖情況變化：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔5 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中培養(yǎng)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。分別于轉(zhuǎn)染后 24h，48h，72h，96h 每孔加入 10μL CCK-8 溶液，放入培養(yǎng)箱中反應(yīng)2h。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450nm處測(cè)定每孔吸光值，比較各組細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

1.2.5 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)：收集各組細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×107/mL，按每只裸鼠0.2mL接種于背部靠左上肢的皮下。裸鼠12只分為3組，即轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組(空白對(duì)照組)，每組4只。裸鼠飼養(yǎng)于南通大學(xué)動(dòng)物中心SPF屏障環(huán)境中，每3天觀察1次，記錄腫瘤的生長(zhǎng)情況及裸鼠的一般狀況。接種6周后，取出腫瘤組織，比較各組裸鼠瘤體的大小及重量，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，運(yùn)用Oneway-ANOVA方法對(duì)多組間差異進(jìn)行單因素方差分析的顯著性檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建和PTP1B小分子干擾RNA對(duì)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制 使用G418篩選后獲得穩(wěn)定表達(dá)LoVo/shRNA和LoVo/negative的LoVo細(xì)胞株。RT-PCR結(jié)果如圖1A所示，LoVo/shRNA組與其他兩組比較,PTP1B mRNA含量明顯減少 (P＜0.05)，LoVo/negative組與正常對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。同樣，Western Blotting結(jié)果如圖1B所示，PTP1B蛋白表達(dá)水平較LoVo/negative組和正常對(duì)照組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖 1 轉(zhuǎn)染后 RT-PCR（A）及 Western Blot（B）檢測(cè) PTP1B mRNA及蛋白表達(dá)情況

用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌 LoVo細(xì)胞后，24h、48h、72h、96h分別用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況如圖2所示。轉(zhuǎn)染LoVo/negative細(xì)胞和正常對(duì)照組細(xì)胞相比，24h、48h、72h、96h 時(shí)細(xì)胞增殖均未受影響 (P＞0.05)。轉(zhuǎn)染LoVo/shRNA細(xì)胞與其它兩組比較在24h時(shí)未受影響，在48h時(shí)開(kāi)始受抑制，72h、96h被明顯抑制(P 均＜0.05)。

圖2 CCK-8檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力的變化

2.2 PTP1B小分子干擾RNA對(duì)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞裸鼠移植成瘤的影響 LoVo/shRNA細(xì)胞，LoVo/negative細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞分別接種12只裸鼠,全部成瘤,每7天檢測(cè)腫瘤體積,繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線如圖3A所示：LoVo/shRNA接種組瘤體積明顯大于LoVo/negative組和對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而LoVo/negative組和正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。7周后將所有裸鼠處死，將所有腫瘤取出稱重，結(jié)果如圖3B所示：腫瘤重量Lo-Vo/shRNA細(xì)胞組明顯大于LoVo/negative組和對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而 LoVo/negative組和正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖3 各組裸鼠腫瘤生長(zhǎng)體積曲線變化（A）及取得的腫瘤組織重量比較（B）

3 討 論

蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）是蛋白酪氨酸磷酸酶超家族（PTPs）的基本類型之一，是一種經(jīng)典的非跨膜性PTP。人類PTP1B基因?yàn)閱慰截惢?，定位于?20 號(hào)染色體 q13.1～13.2，與鼠類 2 號(hào)染色體的H2～H3位點(diǎn)同源[5]。PTP1B在多種腫瘤中發(fā)揮了重要的作用，多項(xiàng)研究證實(shí)PTP1B在不同腫瘤中具有二重性，可以促進(jìn)也可以抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[2]。Kaminski等[6]研究表明，90% 的乳腺癌同時(shí)高表達(dá)PTP1B和c-erbB2，在c-erbB2基因缺失的乳腺癌小鼠中，PTP1B缺失可以延遲腫瘤發(fā)生。同時(shí)發(fā)現(xiàn)PTP1B抑制劑對(duì)乳腺癌進(jìn)入潛伏期及對(duì)肺轉(zhuǎn)移具有抑制作用，進(jìn)一步提示PTP1B在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用[6]。Wiener等[7]采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)卵巢癌組織中PTP1B蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示多數(shù)卵巢癌組織中PTP1B過(guò)表達(dá)，相反在正常卵巢上皮細(xì)胞中PTP1B的陽(yáng)性表達(dá)率非常低，甚至不表達(dá)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，PTP1B的表達(dá)與腫瘤的惡性程度相關(guān)。然而Warabi等[8]發(fā)現(xiàn)，食管癌細(xì)胞中PTP1B mRNA低表達(dá)，明顯低于正常食管黏膜組織。食管癌中PTP1BmRNA表達(dá)量與腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移程度呈負(fù)相關(guān)，提示PTP1B能夠抑制食管癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

已證實(shí)PTP1B在多種腫瘤中發(fā)揮重要作用，然而在結(jié)腸癌中相關(guān)報(bào)告鮮見(jiàn)。Zhu等[4]研究證實(shí)在結(jié)腸癌細(xì)胞中，PTP1B過(guò)度表達(dá)能夠促進(jìn)免疫缺陷小鼠腫瘤生長(zhǎng)的加速，從而加速結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)運(yùn)用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建了針對(duì)PTP1B的干擾質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞后，通過(guò)G418建立穩(wěn)定的沉默PTP1B細(xì)胞。運(yùn)用CCK-8檢測(cè)沉默PTP1B基因后結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力，并且將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shRNA-PTP1B的細(xì)胞植入裸鼠皮下，檢測(cè)轉(zhuǎn)染PTP1B后裸鼠成瘤能力變化。結(jié)果顯示：抑制PTP1B表達(dá)后，其細(xì)胞體外增殖能力明顯降低，體內(nèi)腫瘤成瘤體積亦明顯下降。我們實(shí)驗(yàn)既進(jìn)一步明確PTP1B在結(jié)腸癌中的作用，同時(shí)也探討利用RNA干擾靶向目的基因治療在結(jié)腸癌治療的潛在可能性。

我們認(rèn)為結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)長(zhǎng)期多因素分階段的過(guò)程，其中涉及到多種癌基因的突變和抑癌基因的失活。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PTP1B過(guò)表達(dá)可能與結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，但PTP1B的過(guò)表達(dá)絕不是導(dǎo)致結(jié)腸癌發(fā)生的唯一因素，必定還有許多其他基因或因素的參與。這些基因或因素是什么，它們之間如何相互作用，這些問(wèn)題有待進(jìn)一步的研究。

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