趙天才 楊景鋒 任艷蕓 張永宜 劉飛飛

·論著·

抵當(dāng)芪桂湯對STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠血漿TXB2和血小板表面CD62P、CD63的影響

趙天才 楊景鋒 任艷蕓 張永宜 劉飛飛

目的 觀察抵當(dāng)芪桂湯對糖尿病大鼠血漿血栓素B2（Thromboxane B2，TXB2）含量及血小板表面α顆粒膜糖蛋白（alpha-granularmembrane glycoprotein，CD62p）和血小板溶酶體膜蛋白（lysosome intactmembrane protein，CD63）表達(dá)的影響。方法 70只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法抽取10只為空白組，其余大鼠用鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）復(fù)制糖尿病模型，選取成模大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、格列美脲組、抵當(dāng)芪桂湯大量組、抵當(dāng)芪桂湯常量組，給予相應(yīng)干預(yù)10周后，測定血漿TXB2含量及血小板表面CD62P、CD63的表達(dá)。結(jié)果 干預(yù)10周后，與E組比較，B組、C組、D組大鼠血漿TXB2含量及血小板表面CD62P、CD63表達(dá)率明顯降低，有顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)論抵當(dāng)芪桂湯可通過降低糖尿病大鼠血漿TXB2含量和血小板表面CD62P、CD63表達(dá)率，抑制血小板活化、改善微循環(huán)而阻止或延緩糖尿病血管病變的發(fā)生和發(fā)展。

糖尿??； 抵當(dāng)芪桂湯； CD62P； CD63； TXB2

糖尿病血管病變（diabetic angiopathy，DA）是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥，包括大血管病變和微血管病變，是糖尿病致死、致殘的主要原因之一。研究認(rèn)為長期高血糖使血管內(nèi)皮細(xì)胞的膜蛋白發(fā)生非酶糖基化，可直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，激活血小板，血小板的高黏附、高聚集狀態(tài)造成微循環(huán)淤滯及廣泛微血栓的形成，導(dǎo)致組織缺氧引起微血管病變［1］，而CD62P、CD63和TXB2的高表達(dá)參與了DA的發(fā)生發(fā)展。本實驗通過檢測抵當(dāng)芪桂湯對STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠血清CD62P、CD63和TXB2表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討本方防治DA發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雌性SD大鼠70只（購自西安交通大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK陜2007-001），體質(zhì)量（200±20）g；抵當(dāng)芪桂湯（生黃芪30 g、桂枝10 g、酒大黃10 g、炒白芍15 g、鬼箭羽20 g、水蛭6 g）水煎濃縮液（水煎成含生藥為0.948 g／m l和1.896 g／ml的兩種藥液，置4℃冰箱存儲備用）；格列美脲（2 mg／片，北京賽諾菲—安萬特制藥有限公司，產(chǎn)品批號：B1020）臨用前研細(xì)末，加蒸餾水配成質(zhì)量濃度為0.02 mg／ml的混懸液（4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?，鏈脲佐菌素（美國Sigma公司）；TXB2放射免疫試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所）；異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的CD61抗體（CD61-FITC）、藻紅蛋白（Phycoerythrin，PE）標(biāo)記的抗CD62P的單克隆抗體（CD62P-PE）、藻紅蛋白標(biāo)記的抗溶酶體膜糖蛋白CD63的單克隆抗體（CD63-PE）及同型對照藻紅蛋白標(biāo)記的免疫抗體（immunoglobulin G1-PE，LgG1-PE）試劑盒（均購自北京博奧森生物科技有限公司）；流式細(xì)胞儀（Backman Coulter，型號：FC500）。

1.2 動物分組及造模

70只大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法抽取10只為空白組（A組）。其余大鼠禁食不禁水12小時，按60 mg／kg腹腔注射1%STZ溶液（STZ溶于0.1 mol／L，pH值4.4的檸檬酸緩沖液中，配制成1%濃度）造模。造模72小時后，尾靜脈采血測血糖，隨機(jī)血糖≥16.9 mmol／L者為模型復(fù)制成功。選取成模大鼠40只按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，每組10只：模型組（B組）、格列美脲組（C組）、抵當(dāng)芪桂湯大量組（D組）、抵當(dāng)芪桂湯常量組（E組）。各組大鼠造模后第4天開始灌胃給藥，1次／天，連續(xù)10周。A組、B組灌服蒸餾水1 m l／100 g；C組，灌服0.02 mg／m l格列美脲混懸液1 m l／100 g；D組灌服含抵當(dāng)芪桂湯生藥量1.896 g／m l的水煎濃縮液1 m l／100 g；E組灌服含抵當(dāng)芪桂湯生藥量0.948 g／m l的水煎濃縮液1 m l／100 g。

1.3 指標(biāo)檢測

于干預(yù)第10周末，禁食不禁水12小時后稱體重，10%水合氯醛腹腔注射麻醉動物，下腔靜脈采血法取血3 ml，用109 mmol／L的枸櫞酸鈉按照1∶9的比例抗凝，1200 r／min離心10分鐘，提取富含血小板的血漿，取3支試管并標(biāo)記，在3支試管中各加入CD61-FITC2μl，分別在不同試管中加入CD62P-PE、CD63-PE、LgG1-PE各10μl，再各加入抗凝全血10μl富含血小板血漿及80μl PBS液，室溫避光孵育30分鐘，加入2%多聚甲醛的PBS 500μl，于1小時上機(jī)檢測，用陰性對照管（CD61-FITC＋LgG1-PE）調(diào)整電壓合格后，對測定管檢測，檢測標(biāo)CD62P-PE和CD63-PE；用CD61設(shè)門，分析CD6l門中表達(dá)CD62P和CD63的陽性率，再對血小板進(jìn)行活化分析：CD62P陽性率＝（CD61門中標(biāo)記上CD62P血小板－LgG1血小板）／CD61門中全部血小板100%；CD63陽性率＝（CD61門中標(biāo)記上CD63血小板－LgG1血小板）／CD61門中全部血小板100%。同時取抗凝全血2 m l送陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院用放射免疫法檢測血漿TXB2含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。計量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 干預(yù)后各組大鼠血漿TXB2含量的測定結(jié)果

干預(yù)10周后，與A組比較，其余各組大鼠血漿TXB2含量明顯增高（P＜0.05）；與B組比較，各干預(yù)組大鼠血漿TXB2含量均降低（P＜0.05），其中E組和C組更明顯（P＜0.05），E組優(yōu)于C組（P＜0.05）。如表1所示。

2.2 干預(yù)10周后各組大鼠血小板表面CD62P和CD63表達(dá)率的測定結(jié)果

干預(yù)10周后，與A組比較，B組大鼠血小板表面CD62P和CD63表達(dá)率明顯升高（P＜0.05）；與B組比較，各治療組大鼠血小板表面CD62P和CD63表達(dá)率較低（P＜0.05）；與C組比較，E組和D組大鼠血小板表面CD62P和CD63表達(dá)率較低（P＜0.05）；與D組比較，E組大鼠血小板表面CD62P和CD63表達(dá)率明顯降低（P＜0.05）。如表2所示。

表1 干預(yù)10周后各組大鼠血漿TXB2含量（±s，ng／ml）

表1 干預(yù)10周后各組大鼠血漿TXB2含量（±s，ng／ml）

注：與A組比較，aP＜0.05；與B組比較，bP＜0.05；與C組比較，cP＜0.05。（A組，空白組；B組，模型組；C組，格列美脲組；D組抵當(dāng)芪桂湯大量組；E組，抵當(dāng)芪桂湯常量組；下表同）

組別 例數(shù) TXB 2含量A組75.094±13.147 B組 7 351.02±62.121aC組 8 168.998±38.385abD組 8 248.0925±56.643abE組 8 99.02625±21.024 8 abc

表2 治療后各組大鼠血小板表面CD62P和CD63表達(dá)率（±s，%）

表2 治療后各組大鼠血小板表面CD62P和CD63表達(dá)率（±s，%）

注：與A組比較，aP＜0.05；與B組比較，bP＜0.05；與C組比較，cP＜0.05；與D組比較，dP＜0.05。

組別 例數(shù) CD62PCD63 A組8 0.094±0.021 0.095±0.019 B組 7 0.771±0.136a0.729±0.146aC組 8 0.564±0.104ab0.524±0.128abD組 8 0.336±0.069abc0.318±0.064abcE組 8 0.191±0.045abcd0.162±0.039abcd

3 討論

糖尿病血管病變（diabetic angiopathy，DA）是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥，CD62P和CD63的高表達(dá)參與了糖尿病血管病變的發(fā)生和發(fā)展［2］。血栓素A2（Thromboxane A2，TXA2）主要在血小板中生成和釋放，具有強(qiáng)烈的縮血管和促血小板聚集作用，被認(rèn)為是體內(nèi)血小板活化的特異性標(biāo)志物之一。若TXA2分泌增多即可引起血小板聚集，甚至血栓形成、循環(huán)障礙等病理變化［3］。TXA2在30秒后迅速降解為穩(wěn)定的TXB2，故通常測其代謝產(chǎn)物代表其含量。

糖尿病血管病變屬中醫(yī)“血痹”、“消渴脈痹”范疇；盡管流行病學(xué)資料顯示，近年來該病發(fā)病率以驚人的速度在遞增，但臨床具備“多飲、多食、多尿、消瘦”等“三多一少”癥狀者并不多見，多數(shù)患者是在健康體檢或因并發(fā)癥出現(xiàn)時才被發(fā)現(xiàn)。由于癥狀多不典型，給中醫(yī)辨證帶來困難，很難以“陰虛燥熱”的病機(jī)理論為指導(dǎo)進(jìn)行“三消”分治。結(jié)合長期臨床觀察，課題組認(rèn)為其基本病機(jī)為氣陰兩虛、絡(luò)脈瘀阻，治療當(dāng)以益氣養(yǎng)陰，化瘀通絡(luò)為法。臨床應(yīng)用《傷寒論》抵當(dāng)湯和《金匱要略》黃芪桂枝五物湯化裁組成的抵當(dāng)芪桂湯（由生黃芪、炒白芍、桂枝、水蛭、酒大黃、鬼箭羽等組成），具有益氣養(yǎng)陰、化瘀通絡(luò)之功，用以治療糖尿病及其慢性并發(fā)癥取得了較好的臨床療效。前期研究證實其在改善糖尿病臨床癥狀、緩解并發(fā)癥及改善血管損傷方面療效確切［4-6］。方中生黃芪益氣，炒白芍養(yǎng)陰生津，二者合為君藥，共奏益氣養(yǎng)陰生津之效；酒大黃、水蛭化瘀通絡(luò)，桂枝溫通經(jīng)脈，共為臣藥；佐以鬼箭羽活血化瘀，使血行而不滯，有利于瘀血的祛除。諸藥合用補(bǔ)而不滯，活血而不傷正，共奏益氣養(yǎng)陰，化瘀通絡(luò)之功。本實驗研究顯示，抵當(dāng)芪桂湯能夠有效降低STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠血漿TXB2含量，抑制血小板表面CD62P和CD63表達(dá)，且效果明顯優(yōu)于格列美脲，提示抵當(dāng)芪桂湯可能通過抑制或延緩血小板活化，改善血小板功能，阻止廣泛微血栓的形成而起到防治糖尿病血管病變的作用。

［1］ 盧芙蓉，沈霖，秦鈾，等.2型糖尿病患者血小板膜糖蛋白Ib／IX／V復(fù)合物表達(dá)的研究［J］.中國全科醫(yī)學(xué)，2008，11（6）：470-473.

［2］ 池曉霞，陳劍雄，蓋俊惠.非INS依賴型糖尿病患者血小板活化與微血管病變關(guān)系初探［J］.放射免疫學(xué)雜志，2009，22（2）：140-142.

［3］ 李萍，彌曼，杜洪霞，等.亞硒酸鈉對糖尿病大鼠血小板聚集功能的影響［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010，30（1）：193-194.

［4］ 楊景鋒，趙天才，任艷云，等.抵當(dāng)芪桂湯對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響［J］.中國全科醫(yī)學(xué)，2010，13（48）：1201-1203.

［5］ 楊景鋒，趙天才，任艷蕓，等.抵當(dāng)芪桂湯對STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠心肌VEGFmRNA表達(dá)的影響［J］.中藥材，2011，34（3）：420-424.

［6］ 楊景鋒，趙天才，王祥森，等.抵當(dāng)芪桂湯對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病大鼠心肌CTGF、α-SMA表達(dá)的影響［J］.時珍國醫(yī)國藥，2012，23（2）：363-364.

Effects of Didang Qigui Decoction on blood plasma TXB2 and platelet surface CD62P／CD63 inSTZ-induced diabetes rats

ZHAO Tian-cai，YANG Jing-feng，REN Yan-yun，et al.Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang 712046，China

YANG Jing-feng，E-mail：yangjingfeng1970＠126.com

Objective To observe therapeutic effects of Didang QiguiDecoction upon ratswith diabetes that is induced by streptozoticin（STZ）by examining the levels of TXB2in blood plasma and granule membrane glycoprotein（CD62P），lysosomal interalmembrane protein（CD63）in platelet surface.M ethod 10 out of70 female rats are chosen randomly as the blank control group（group A），then the rest are induced by STZ，waiting to develop diabetes ratswhich，afterwards，are divided randomly intomodel group（group B），glimepiride group（group C），maximum dosage group of the Decoction（group D），and Didang Qigui Decoction normal-dose group（group E）.10 weeks intervention is given to all the above groups and the levels of TXB2in blood plasma and CD62P，CD63 in platelet surface in each group aremeasured.Result After 10 weeks of intervention，comparing with group E，the levels of TXB2in blood plasma and CD62P，CD63 in platelet surface were decreased in group B，group C and group D（P＜0.05）.Conclusion It is possible that Didang Qigui Decoction restrains platelet activation and improvesmicrocirculation by reducing blood plasma TXB2and platelet surface CD62P，and CD63 content and further prevents or delays the occurrence and development of diabetic angiopathy.

Diabetic mellitus； Didang Qigui Decoction； CD62P； CD63； TXB2

R285.5

A

10.3969／j.issn.1674-1749.2013.09.004

2013-07-09）

（本文編輯：董歷華）

陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計劃（2011JM4017）；陜西省教育廳專項科研計劃（11JX06751）

712046咸陽，陜西中醫(yī)學(xué)院中醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)［趙天才、楊景鋒、張永宜（碩士研究生）］；陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎病科（任艷蕓）；河南省洛陽新區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)一科（劉飛飛）

趙天才（1955－），碩士，教授。研究方向：經(jīng)方防治糖尿病及其并發(fā)癥研究。E-mail：ztc9905＠aliyun.com

楊景鋒（1970－），碩士，副教授。研究方向：中醫(yī)藥防治糖尿病及其并發(fā)癥研究。E-mail：yangjingfeng1970＠126.com