王春燕 吉春冬

（1 四川省攀枝花市攀鋼總醫(yī)院功能科，四川 攀枝花617000；2 四川省攀枝花市攀鋼總醫(yī)院泌尿外科；四川 攀枝花617000）

孕前診斷劑量超聲輻照對仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

王春燕1吉春冬2

（1 四川省攀枝花市攀鋼總醫(yī)院功能科，四川 攀枝花617000；2 四川省攀枝花市攀鋼總醫(yī)院泌尿外科；四川 攀枝花617000）

目的探討孕前診斷劑量超聲輻照對子代生長發(fā)育及學(xué)習(xí)記憶能力是否有影響。方法對孕前1周Wistar大鼠分別給予每日10min，20min，30min診斷劑量（3.5MHz，65Mw/cm2MI=1.6，Tis=1.8）的超聲輻照，并給予對照組假輻照。一周后雌雄大鼠合籠使之自然受孕及分娩，待仔鼠出生后觀察其發(fā)育情況（如出生體質(zhì)量、睜眼時(shí)間、皮毛發(fā)育情況等）及出生病死率，并于出生后第90d進(jìn)行Morris水迷宮測試，評價(jià)其學(xué)習(xí)記憶能力。結(jié)果照射組與對照組仔鼠發(fā)育狀態(tài)及出生病死率無明顯差異（P＞0.05）。30min組仔鼠在水迷宮測試中內(nèi)環(huán)得分（0.1201±0.0799）與對照組得分（0.2135±0.0831）之間的差異具有顯著性（P＜0.05）。20min以下照射組與對照組的內(nèi)環(huán)得分無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)論給予孕前雌鼠診斷劑量的超聲輻照30min對仔鼠的學(xué)習(xí)記憶能力可產(chǎn)生影響。

超聲輻射；Morris水迷宮；學(xué)習(xí)記憶；大鼠

隨著現(xiàn)代社會(huì)的工業(yè)化發(fā)展和人類生活方式的巨大改變，不孕患者的比率在全世界范圍內(nèi)越來越高。超聲檢查作為一種便捷、無創(chuàng)、可重復(fù)手段成為生殖醫(yī)學(xué)實(shí)踐中不可缺少的工具，尤其在孕卵監(jiān)測中起到關(guān)鍵性作用。在此背景下，超聲輻射的安全性問題得到世界范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注。國內(nèi)外學(xué)者已對早孕期胎兒進(jìn)行不同劑量超聲輻照所致組織、細(xì)胞損害進(jìn)行大量研究，但目前針對孕前超聲輻照對孕卵影響的研究甚少。Morris水迷宮是公認(rèn)的能夠真實(shí)、客觀地測定動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的實(shí)驗(yàn)裝置。本研究就是對大鼠孕前卵細(xì)胞進(jìn)行不同劑量超聲輻照，并利用Morris水迷宮來觀察仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化，從而為超聲在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的安全應(yīng)用提供具有臨床價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組

健康性成熟WISTAR大鼠60只（由濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），其中雄性20只，雌性40只。按完全隨機(jī)的方法將40只雌鼠分為對照組及照射組。照射組按照射時(shí)間分為：10min組、20min組、30min組。

1.2 動(dòng)物模型的制備

雌鼠在孕前一周，選取1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉方法，劑量為30mg/kg，麻醉滿意后，將雌鼠縛于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，下腹部涂耦合劑，超聲探頭在雌鼠下腹部按既定的時(shí)間進(jìn)行滑行掃查，對照組進(jìn)行假輻照，其余條件相同，每日一次，連續(xù)輻照7d后將雌雄按2?1比例合籠，使之自然受孕及分娩。

1.3 超聲輻照條件

儀器：GE 730型彩色超聲診斷儀；輻照條件：4V1探頭，頻率3.5MHz；機(jī)械指數(shù) MI =1.6，熱指數(shù) Tis＝1.8；ISPTP：1mW/cm2；ISATA：240 mW/ cm2。40只雌鼠共產(chǎn)下仔鼠327只，仔鼠出生后觀察其發(fā)育情況（出生體質(zhì)量、睜眼時(shí)間、皮毛發(fā)育情況等）及出生病死率。

1.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

隨機(jī)選取各組仔鼠10只，在成熟期（生后90d）進(jìn)行測試。根據(jù)動(dòng)物在每一區(qū)內(nèi)花費(fèi)的時(shí)間，與規(guī)定的加權(quán)值相乘，結(jié)果相加來計(jì)算學(xué)習(xí)記憶成績。Morris水迷宮是一高50cm、直徑160cm的圓形水池，水池內(nèi)壁為黑色，池內(nèi)水深23cm，水溫在（22±2）℃，實(shí)驗(yàn)室溫度24～25℃，房間內(nèi)光照恒定，水池內(nèi)無光線直射。池壁上以四個(gè)等距離的點(diǎn)將水池分為四個(gè)象限，第一象限設(shè)為目標(biāo)象限，在距離池壁35cm處放有一個(gè)高21cm、直徑為12cm、的圓形黑色站臺(tái)，Morris水迷宮中加入墨汁混勻，水中不能明顯見到安全平臺(tái)。水池四周存在豐富的空間參考線索（門、窗、燈、實(shí)驗(yàn)者等），應(yīng)保持不變以供大鼠定位平臺(tái)。迷宮上方安置帶有顯示系統(tǒng)的攝像機(jī)，同步記錄仔鼠運(yùn)動(dòng)軌跡。本實(shí)驗(yàn)我們選取內(nèi)環(huán)得分作為學(xué)習(xí)、記憶能力的評價(jià)指標(biāo)。

1.5 內(nèi)環(huán)得分

用SPSS17.0軟件，實(shí)驗(yàn)所獲的數(shù)據(jù)采用（χ—±s）表示，主要統(tǒng)計(jì)分析采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

見表1。

表1 輻照組與對照組的內(nèi)環(huán)得分

孕前給予超聲輻照30 min組的雌鼠所產(chǎn)仔鼠出生后90d在Morris水迷宮測試中內(nèi)環(huán)得分與對照組的差異具有顯著性意義（P＜0.05）。孕前給予超聲輻照10min組及20 min組的雌鼠所產(chǎn)仔鼠在Morris水迷宮測試中所得分?jǐn)?shù)均與對照組無明顯差異（P＞0.05）。

3 討 論

超聲檢查作為一種便捷、無創(chuàng)、可重復(fù)手段成為生殖醫(yī)學(xué)實(shí)踐中不可缺少的工具，尤其在孕卵監(jiān)測中起到關(guān)鍵性作用。在此背景下，超聲輻射的安全性問題得到世界范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注。國內(nèi)學(xué)者已對早孕期及晚孕期胎兒不同劑量超聲輻照所致組織、細(xì)胞損害進(jìn)行大量研究，目前針對孕前超聲輻照對孕卵影響的研究甚少。超聲輻照孕卵是否會(huì)導(dǎo)致子代腦功能的損害還是一個(gè)全新的研究領(lǐng)域。目前有研究已經(jīng)證實(shí)孕期給予超聲輻照可引起胎兒腦組織細(xì)胞的凋亡。段云友等[1]研究發(fā)現(xiàn)給予診斷劑量的超聲輻照可引起胎鼠小腦外顆粒層細(xì)胞的凋亡；程顏苓等[2]采用診斷劑量超聲輻照孕18d的胎鼠，證實(shí)超聲輻照射超過20min即可誘導(dǎo)胎鼠腦皮層組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡。另有研究證實(shí)超聲輻照大鼠生殖系統(tǒng)對精細(xì)胞及卵巢細(xì)胞有損傷作用，其影響程度與輻照時(shí)間長短有關(guān)。如張希平等[3]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)診斷劑量超聲照射可引起小鼠睪丸和精細(xì)胞的形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)變化，并發(fā)現(xiàn)輻照時(shí)間相同而輻照次數(shù)不同的精子畸變率無明顯差異，提示超聲輻照對生精細(xì)胞損傷的程度主要取決于輻照時(shí)間，與輻照的頻率關(guān)系不大，與劉望彭等[4]的研究結(jié)論相一致。曹敏麗等[5]通過照射大鼠卵巢相應(yīng)部位10min，偶見c-fos的表達(dá)，隨照射時(shí)間延長陽性表達(dá)呈上升趨勢，至60min時(shí)陽性表達(dá)最高；持續(xù)照射30min可致c-fos-mRNA陽性表達(dá)升高，即超聲持續(xù)輻照大鼠卵巢達(dá)到一定時(shí)間后可導(dǎo)致卵巢細(xì)胞的免疫組織發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，并通過c-fos和c-fos-mRNA系統(tǒng)途徑誘導(dǎo)卵巢細(xì)胞的凋亡。目前對于超聲輻照引起的子代腦功能損害的研究相對匱乏，Kieler等的研究發(fā)現(xiàn)胎兒時(shí)期接受超聲檢查會(huì)導(dǎo)致左利手的概率增加。周寧等對孕18d的SD大鼠給予診斷劑量（3.0MHz，MI=1.6，Tis=1.8）的超聲輻照，30min組仔鼠在水迷宮測試中內(nèi)環(huán)得分與對照組之間的差異具有顯著性（P＜0.05），對孕鼠給予診斷劑量的超聲輻照30 min可導(dǎo)致仔鼠的學(xué)習(xí)記憶能力下降。本實(shí)驗(yàn)采取Morris水迷宮對仔鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力進(jìn)行測定。在動(dòng)物學(xué)習(xí)、記憶實(shí)驗(yàn)研究上，儀器和方法是重要的，Morris水迷宮是經(jīng)典的研究動(dòng)物學(xué)習(xí)、記憶的儀器，其優(yōu)點(diǎn)：用攝像系統(tǒng)代替了肉眼觀察，可避免人為因素的影響，更為真實(shí)、客觀；依靠計(jì)算機(jī)系統(tǒng)和程序，不僅能測定各種實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，還能自動(dòng)顯示動(dòng)物游泳軌跡。本實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)環(huán)得分作為評價(jià)指標(biāo)。在實(shí)驗(yàn)中，照射30min組動(dòng)物游迷宮形式呈周邊型。而對照組及照射10min組、20min組動(dòng)物經(jīng)過3～5d的加強(qiáng)訓(xùn)練，大部分能夠快速、準(zhǔn)確找到平臺(tái)位置。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在孕前給予超過30min的診斷劑量超聲輻照的雌鼠其子代的學(xué)習(xí)記憶能力下降。原因主要考慮為卵細(xì)胞對超聲輻照敏感，超聲的熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)及空化效應(yīng)等導(dǎo)致卵細(xì)胞發(fā)育異常。在生長發(fā)育敏感期的胎兒，即使少量細(xì)胞的損傷也可能引起嚴(yán)重的后果。凋亡是依賴能量的細(xì)胞內(nèi)死亡程序活化而致的細(xì)胞自我清除，凋亡過多則導(dǎo)致過多的細(xì)胞死亡，影響臟器甚至機(jī)體的功能導(dǎo)致疾病。神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育是在神經(jīng)細(xì)胞的增殖與自然凋亡的動(dòng)態(tài)平衡中進(jìn)行的。超聲的生物學(xué)效應(yīng)會(huì)成為影響腦細(xì)胞凋亡的因素。陳文雪等在研究診斷劑量超聲對大鼠卵巢細(xì)胞凋亡的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，超聲輻照可誘發(fā)卵巢組織細(xì)胞凋亡，而且處于不同發(fā)育時(shí)期的卵泡內(nèi)細(xì)胞敏感度不同，不僅發(fā)生在原始卵泡、生長卵泡，在間質(zhì)細(xì)胞及卵泡膜細(xì)胞也可發(fā)現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象。給予診斷劑量超聲輻照30min，12h后其細(xì)胞凋亡率增加，24h達(dá)到高峰，48h凋亡率開始下降，96h細(xì)胞凋亡率繼續(xù)下降，120h恢復(fù)至對照組水平。診斷劑量的超聲輻照大鼠卵巢組織后細(xì)胞凋亡率隨時(shí)間變化的曲線呈近似拋物線狀。由此證明診斷劑量超聲輻照大鼠卵巢可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加，這種損害存在一定的可復(fù)性，且細(xì)胞凋亡率與超聲輸出功率呈正相關(guān)。如果發(fā)育期的卵細(xì)胞接受超聲輻照不但引起卵細(xì)胞凋亡增加，間質(zhì)細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞的凋亡增多也會(huì)引起卵細(xì)胞發(fā)育異常，打破胎鼠腦組織發(fā)育的動(dòng)態(tài)平衡，可能表現(xiàn)為其出生后的學(xué)習(xí)、記憶能力的下降。因此在臨床常規(guī)超聲檢查時(shí)應(yīng)盡量避免長時(shí)間的輻照。

[1] Oh H,Lee SE,Yang JA,et al.Establishment of a biological indicatorfor the radiation and safety of diagnostic ultrasound using apoptosis[J].In Vivo,2000,14(4):345-349.

[2] 程顏苓,段云友,曹鐵生.診斷劑量超聲與胎鼠中樞神經(jīng)元的凋亡[J].中華超聲影像學(xué)雜志,2001,10(9):624-626.

[3] 張希平,曹曉哲,張紹增,等.診斷超聲對小鼠精細(xì)胞影響的研究[J].中華超聲影像學(xué)雜志,1998,7(4):245.

[4] 劉望彭,梁光榮,劉晉敏,等.不同孕期不同條件超聲輻照對胎鼠生長發(fā)育的影響[J].中國超聲醫(yī)學(xué)雜志,1996,12(5):9.

R711.6；R-332

B

1671-8194（2013）18-0099-02