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西藏小型豬毛乳頭細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

2013-07-19 02:40:44龍朝欽劉海燕
實(shí)用皮膚病學(xué)雜志 2013年1期
關(guān)鍵詞:豬毛平皿傳代

羅 洋,杜 華,鞠 英,王 潔,龍朝欽,高 劍,劉海燕

毛乳頭細(xì)胞在毛囊的發(fā)育及周期性生長(zhǎng)調(diào)控中起重要作用。要闡明毛乳頭細(xì)胞對(duì)調(diào)節(jié)毛囊生長(zhǎng)和發(fā)育的機(jī)制,必須從毛乳頭細(xì)胞自身分泌的生物活性成分著手[1]。我們?cè)诮⑷嗣轭^細(xì)胞體外培養(yǎng)模型基礎(chǔ)上,應(yīng)用低傳代人毛乳頭細(xì)胞的培養(yǎng)上清制成條件培養(yǎng)基,發(fā)現(xiàn)其在體外有明顯的生物學(xué)活性[2],并將毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液制成凍干粉,初步應(yīng)用于脫發(fā)患者的治療,發(fā)現(xiàn)其有確切的治療作用[3,4]。但人毛乳頭細(xì)胞來(lái)源有限,制約其進(jìn)一步研究,擬用豬毛乳頭細(xì)胞替代人毛乳頭細(xì)胞,希望能研究出人毛乳頭細(xì)胞的替代細(xì)胞。本研究應(yīng)用西藏小型豬毛乳頭細(xì)胞進(jìn)行分離與培養(yǎng),觀察其培養(yǎng)條件和細(xì)胞生物行為,為進(jìn)一步分析和研究豬毛乳頭細(xì)胞生長(zhǎng)活性蛋白奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 DMEM 培養(yǎng)基(低糖)、分離酶、Ⅳ型膠原酶(Sigma 公司),D-Hanks 液、Hanks 液、新生小牛血清(Hyclone 公司),Hepes(Boehringer Mannheim 公司),胰蛋白酶(華美生物工程公司)。完全培養(yǎng)基以DMEM 培養(yǎng)基為基礎(chǔ),其主要成分的終濃度分別為:1 000 ml DMEM 液中含2.4 g Hepes,0.3 g L-谷氨酰胺,10 萬(wàn)U /L 青霉素,10 萬(wàn)U /L 鏈霉素,調(diào)整pH 值至7.3 左右,使用前加入小牛血清至濃度為15%。

1.1.2 組織來(lái)源 2 月齡西藏小型豬背部皮膚。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 豬毛乳頭細(xì)胞的分離 在西藏小型豬背部無(wú)菌條件下取一直徑5 cm 左右全層皮膚,在無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行下列操作:①在超凈臺(tái)上將已處理好的豬皮在不銹鋼腎形彎盤(pán)中用75%乙醇漬泡20 min,75%乙醇棉球擦洗2 遍,然后以吸管用生理鹽水反復(fù)用力沖洗3 遍;②用組織剪剪去標(biāo)本邊緣部分,將豬皮放在已消毒好的木板上,用手術(shù)刀分離筋膜層,眼科剪清理殘留的筋膜層;③用組織剪將處理干凈的標(biāo)本剪成0.3 ~0.5 cm 寬,3 ~4 cm 長(zhǎng)的皮條,再將皮條從真皮-皮下脂肪層交界處剪開(kāi);④將脂肪層組織置于直徑為5 cm 的平皿中,加入0.5%分離酶浸沒(méi),將平皿放入已消毒好的不銹鋼飯盒中,4 ℃過(guò)夜;⑤次日再將平皿37 ℃熱消化30 min,以生理鹽水將組織漂洗2 次,用眼科鑷將組織內(nèi)殘留毛囊下段擠出;⑥用組織剪將脂肪組織剪成米粒樣大小,以0.2%Ⅳ型膠原酶于平皿中37 ℃消化4 h;⑦將尚未消化組織去除,向消化液中加入等量DMEM 后移入50 ml 離心管中離心,2 000 r/ min 離心10 min,傾去上清液,管底沉淀組織移入含DMEM 的平皿中清洗,將其中網(wǎng)絡(luò)的大量豬毛乳頭洗下,洗下液體再加入50 ml 離心管中離心,1 000 r/ min 離心5 min;⑧將清洗液移入10 ml 的離心管中500 r/ min 低速離心3 ~4 次,每次3 min,每次吸去上清液;⑨在10 ml 的離心管中以1 000 r/ min 離心5 min,去上清后加入含15%胎牛血清的完全培養(yǎng)基后接種。

1.2.2 豬毛乳頭細(xì)胞的培養(yǎng) 將豬毛乳頭每瓶80 ~100 個(gè)接種于50 ml 一次性培養(yǎng)瓶中,在37 ℃ 5%CO2飽和水氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待大部分豬毛乳頭貼壁后,更換培養(yǎng)基,細(xì)胞融合后可進(jìn)行1∶3 傳代培養(yǎng)。

2 結(jié)果

2.1 豬毛乳頭細(xì)胞的分離

每次可獲得超過(guò) 1 000 枚毛乳頭,新分離的毛乳頭呈橢圓形或圓形。

2.2 豬毛乳頭細(xì)胞的培養(yǎng)

獲得豬毛乳頭后接種培養(yǎng)瓶做懸浮培養(yǎng),接種后豬毛乳頭細(xì)胞從豬毛乳頭邊緣中長(zhǎng)出(圖1a),逐步向四周呈放射狀生長(zhǎng)(圖1b),此時(shí)豬毛乳頭逐漸失去其原來(lái)的形狀,形成成片的細(xì)胞生長(zhǎng)致密區(qū),最后散開(kāi)的豬毛乳頭細(xì)胞開(kāi)始逐漸融合,融合后細(xì)胞大致仍由呈放射狀排列的多個(gè)細(xì)胞團(tuán)組成,中央?yún)^(qū)細(xì)胞出現(xiàn)多層化,并向上堆積形成凝集性生長(zhǎng)(圖1c)。

2.3 豬毛乳頭細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

經(jīng)胰酶消化并傳代的毛乳頭細(xì)胞,逐漸重新傾向凝集生長(zhǎng),隨著時(shí)間的增加,凝集生長(zhǎng)現(xiàn)象逐漸明顯(圖2a)。但隨著豬毛乳頭細(xì)胞傳代次數(shù)增加,凝集性生長(zhǎng)現(xiàn)象逐漸消失(圖2b),6 代以后的豬毛乳頭細(xì)胞基本不再出現(xiàn)凝集性生長(zhǎng)現(xiàn)象(圖2c)。

3 討論

研究表明,位于毛囊基底部的特殊間質(zhì)成分——毛乳頭在毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育、周期調(diào)控及維持毛發(fā)生長(zhǎng)中起主導(dǎo)作用。毛乳頭的功能障礙是導(dǎo)致毛囊周期失衡和休止期脫發(fā)的主要起始因素[5]。因此研究毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育、調(diào)控機(jī)制應(yīng)不能脫離毛乳頭細(xì)胞的功能狀態(tài),對(duì)這方面的研究已逐漸成為毛囊生長(zhǎng)、發(fā)育及周期調(diào)控的熱點(diǎn)。目前對(duì)毛乳頭細(xì)胞的研究已發(fā)現(xiàn)一些活性蛋白及細(xì)胞因子對(duì)毛囊的生長(zhǎng)有調(diào)節(jié)作用,培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞最明顯的特性是細(xì)胞融合前易于形成多層化的細(xì)胞團(tuán),即所謂凝集性生長(zhǎng)的特性[2]。在前期的研究中,我們證實(shí)了毛乳頭細(xì)胞在體外凝集性生長(zhǎng)狀態(tài)下的生物學(xué)功能明顯強(qiáng)于非凝集性生長(zhǎng),有較強(qiáng)的誘導(dǎo)毛囊形成能力,而在非凝集性生長(zhǎng)狀態(tài)這種特性則減弱甚至消失[2-4]。因此,毛乳頭的凝集性生長(zhǎng)狀態(tài)可能與其調(diào)控毛囊生長(zhǎng)功能有著緊密聯(lián)系。

圖1 原代培養(yǎng)豬毛乳頭細(xì)胞(4×10)

西藏小型豬來(lái)源于青藏高原、海拔2 500 ~4 300 m的農(nóng)區(qū)和半農(nóng)牧區(qū),是惟一能夠適應(yīng)高海拔氣候和以放牧為主的豬種,抗逆性好,封閉的地理環(huán)境使西藏小型豬保存了非常純正的品種資源。我們?cè)谝呀⒑透倪M(jìn)的二步酶消化法基礎(chǔ)上,應(yīng)用手術(shù)刀分離豬皮膚組織,1 h 內(nèi)即可分離一直徑5 cm 左右豬皮,相對(duì)于以往用眼科剪分離皮下筋膜層,大大減少了工作量,節(jié)省了分離時(shí)間。在用酶消化時(shí),采用無(wú)菌不銹鋼盒封裝后才拿出超凈臺(tái),可明顯克服此步被污染的可能性;Ⅳ型膠原酶于平皿中37 ℃消化4 h,可分離到大量高純度的毛乳頭;本實(shí)驗(yàn)采用膠原酶對(duì)細(xì)胞的消化作用比較緩慢、溫和,對(duì)毛乳頭細(xì)胞的損傷和刺激不大,分離獲得的毛乳頭細(xì)胞體外培養(yǎng)生長(zhǎng)迅速。

西藏小型豬毛乳頭細(xì)胞低傳代時(shí)細(xì)胞呈凝集性生長(zhǎng),6 代后呈非凝集性生長(zhǎng),這與人毛乳頭細(xì)胞生物學(xué)相似[2],其低傳代培養(yǎng)上清可作為條件培養(yǎng)基進(jìn)一步研究。西藏小型豬對(duì)人抗原性較弱,不易過(guò)敏,是目前研究毛囊較為理想的研究對(duì)象。

[1] Soma T, Fujiwara S, Shirakata Y, et al. Hair-inducing ability of human dermal papilla cells cultured under Wnt/β-catenin signalling activation [J]. Exp Dermatol, 2012, 21(4):307-309.

[2] 羅洋, 郝飛, 鐘白玉, 等. 條件培養(yǎng)基對(duì)高傳代人毛乳頭細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 [J]. 中華皮膚科雜志, 2004, 37(11):648-650.

[3] 羅洋, 杜華, 王潔, 等. 人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液治療女性脫發(fā)的臨床療效觀察 [J]. 西北國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 32(1):1-3.

[4] 羅洋, 郝飛, 杜華, 等. 人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液治療雄激素源性脫發(fā)的臨床觀察 [J]. 中國(guó)美容醫(yī)學(xué), 2009, 18(7):980-982.

[5] Kawano M, Han J, Kchouk ME, et al. Hair growth regulation by the extract of aromatic plant Erica multiflora [J]. J Nat Med, 2009, 63(3):335-339.

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