第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院整形科（西安710032） 張冠華 易成剛 馬戈甲 楊 力

基質(zhì)金屬蛋白酶9（Matrix metalloproteinase 9，Mmp9）是92 k Da IV型膠原酶的糖化形式，其底物是變性的間質(zhì)膠原、V型膠原和IV型膠原。它通過切割包括彈性蛋白、纖維連接蛋白和層粘連蛋白在內(nèi)的非膠原細(xì)胞外基質(zhì)來破壞血管結(jié)構(gòu)，為腫瘤侵襲性生長、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移提供條件［1］。因此，日益引起學(xué)者重視。

RNA干擾 （RNA interf erence，RNAi）是內(nèi)源性基因或人工導(dǎo)入基因，是進(jìn)入細(xì)胞后與靶基因互補(bǔ)的小干擾雙鏈RNA（si RNA）序列引起轉(zhuǎn)錄后基因沉默的一種現(xiàn)象［2］。因其簡便易行并且具有特異性和高效性，已經(jīng)成為研究基因功能和基因表達(dá)調(diào)控的重要方法。本研究構(gòu)建靶向抑制小鼠Mmp9的si RNA干擾載體，并進(jìn)行慢病毒包裝制成慢病毒濃縮液，為血管化性疾病的防治研究提供理論依據(jù)及實驗室數(shù)據(jù)。

材料和方法

1 主要試劑和儀器 慢病毒載體系統(tǒng)由p SILRFP載體、p Hel per1．0載體和p Helper2．0載體三質(zhì)粒組成。大腸桿菌菌株DH5α感受態(tài)細(xì)胞。LB培養(yǎng)基（Sig ma，美國）；PCR試劑盒（Takara，大連）；ds DNA oligo（奧科生物，北京）；質(zhì)粒小提試劑盒（Bio mega，美國）；質(zhì)粒大提試劑盒（Qiagen，美國）；CaCl2（Sig ma，美國）；Mg SO4（Sig ma，美國）；T4DNA ligase試劑盒（NEB，英國）；瓊脂糖（賽百盛，北京）；限制性內(nèi)切酶（NEB，英國）；測序（華大基因，北京）。

2 方 法

2．1 sh RNA的設(shè)計：針對靶基因序列，按照RNA干擾設(shè)計序列設(shè)計原則，運(yùn)用美國Ambition公司的軟件設(shè)計攜帶小鼠Mmp9基因（NM－013599）si RNA序列的sh RNAs結(jié)構(gòu)單鏈寡核苷酸，并合成3對單鏈寡核苷酸。每一正向單鏈內(nèi)的寡核苷酸以正反向組合，中間添加Loop結(jié)構(gòu)，使寡核苷酸形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，每對寡核苷酸兩端分別帶有AgeΙ和Eco RΙ酶切位點(diǎn)。

2．2 Mmp9－sh RNA慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建：在37°C條件下用限制性內(nèi)切酶AgeⅠ（ACCGGT）和Eco RⅠ（GAATTC）酶切p SIL－RFP載體以使其線性化，將酶切回收的線性載體質(zhì)粒和退火的雙鏈DNA連接，連接反應(yīng)條件如下：退火產(chǎn)物（按1∶100稀釋）5μl，p SIL－RFP（100ng）3μl，T4DNA ligase（NEB）1μl，10×Ligation Buff er 2μl，Sterile water 9μl共20μl反應(yīng)體系于16℃，連接過夜，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化。取10μl連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌，轉(zhuǎn)化后菌鋪至LB－Ampr＋平板，37℃溫箱孵育過夜。挑取平板上長出的單克隆至LBAmpr＋液體培養(yǎng)基，37℃，200r p m，振蕩培養(yǎng)15h，提取細(xì)菌培養(yǎng)物中的質(zhì)粒。步驟按照小量提取質(zhì)粒的方法進(jìn)行（質(zhì)粒提取純化試劑盒，Bio mega）。

2．3 PCR鑒定及DNA測序：挑取重組陽性克隆進(jìn)行PCR鑒定，并設(shè)陰性對照（排除系統(tǒng)中外源核酸污染導(dǎo)致的假陽性結(jié)果）。PCR鑒定陽性克隆的上游引物（＋）5’－CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA－3’和下游引物（－）5’－GTAATACGGTTATCCACGCG －3’，PCR 條 件：94℃30s－94℃30s－55℃30s－72℃30s－72℃30s，30個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。挑出陽性克隆進(jìn)行測序。測序準(zhǔn)確后，該陽性 克 隆 分 別 命 名 為 p SIL－RFP/Mmp9－sh RNA1，p SIL－RFP/Mmp9－sh RNA2， p SIL－RFP/Mmp9－sh RNA3。

2．4 高效Mmp9－sh RNA慢病毒質(zhì)粒的篩選：①M(fèi)mp9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前1d接種細(xì)胞于6孔板，2 ml無抗生素培養(yǎng)基每孔，第2天轉(zhuǎn)染時細(xì)胞達(dá)到60%～80%每孔。在一管中將5μg pc DNA3．1（＋）/Mmp9質(zhì)粒分別與240μl Opti－MEM 無血清培養(yǎng)基混合，然后在另一管中取10μl lipofectamine 2000與240μl Opti－MEM無血清培養(yǎng)基，均在室溫下靜止5 min。再把兩管混合，室溫靜止20 min后，將混合液均勻加入6孔板，37°C培養(yǎng)48h。②半定量RT－PCR篩選高效 Mmp9－sh RNA質(zhì)粒：分別提取各組RNA，根據(jù)Mmp9的基因信息，運(yùn)用Pri mer Premier 5．0軟件，設(shè)計上下游引物擴(kuò)增Mmp9的部分CDS區(qū)。Mmp9－S：5＇ACGGCAACGGAGAAGGCAAAC3＇，Mmp9 ‐ AS：5＇GCTTAGAGCCACGACCATACAGATA3’，β‐actin‐669S：5＇CGTGACATTAA GGAGAAGCTG3＇，β‐actin‐1169：5＇CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC3＇。PCR條件如下：94℃3 min－94℃40s－56℃60s－72℃60s－25cycle－72℃10s。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行半定量RT－PCR驗證，以β－actin（PCR產(chǎn)物長度為500bp）為內(nèi)參，用凝膠成像系統(tǒng)記錄觀察結(jié)果，并用Lab wor ks 4．0凝膠分析軟件對電泳結(jié)果進(jìn)行分析，并進(jìn)行定量分析。③Wester n blot篩選高效Mmp9－sh RNA質(zhì)粒：轉(zhuǎn)染72h后加入RIPA裂解液收集蛋白，10%的 SDS－PAGE凝膠電泳，4°C 350 mA 下電轉(zhuǎn)移120 min，將蛋白樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，雜交封閉一二抗孵育后，最后用 Wester n Lightning（R）– ECL，Enhanced Chemilu minescence Substrate（Per kin El mer，NEL100001EA）檢測，顯影。挑選出最佳重組p SIL－RFP/Mmp9－sh RNA 質(zhì)粒，準(zhǔn)備將其制成慢病毒。

2．5 慢病毒包裝：將對數(shù)生長期的293T細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為6×105/ml。接種于15 c m細(xì)胞培養(yǎng)皿，37℃ 、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時即可用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2 h將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。向一滅菌離心管中加入所制備的各DNA溶液（p SIL－RFP 載 體 20μg，p Helper 1．0 載 體 15μg，p Hel per 2．0載體10μg），與相應(yīng)體積的 Opti－MEM 混合均勻，調(diào)整總體積為2．5 ml，在室溫下溫育5 min。將Lipofecta mine 2000試劑輕柔搖勻，取100μl Lipofectamine 2000試劑在另一管中與2．4 ml Opti－MEM混合，在室溫下溫育5 min。把稀釋后的DNA與稀釋后的Lipof ectamine 2000進(jìn)行混合，室溫下溫育20 min后。將該混合液轉(zhuǎn)移至293 T細(xì)胞的培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)。8 h后倒去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)基，每瓶細(xì)胞加入20 ml的PBS液洗滌后，加入含10% 血清的細(xì)胞培養(yǎng)基25 ml，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48h。收集上清液，于4℃，4000 g 離心10 min，除去細(xì)胞碎片。以0．45μm濾器過濾上清液于40 ml超速離心管濃縮，即為病毒濃縮液。將病毒濃縮液移出，分裝后保存在病毒管中，－80℃長期保存，進(jìn)行病毒生物學(xué)滴度測定。

結(jié) 果

1 Mmp9基因sh RNAs序列：經(jīng)設(shè)計并合成的Mmp9基因1～3序列，正義鏈（sense strand，S鏈）及反義鏈（antisense strand，A鏈）DNA，見表1。

2 連接轉(zhuǎn)化產(chǎn)物陽性克隆的PCR鑒定：連接入片段的陽性克隆PCR片段大小為：343bp（從載體中切掉24bp）；沒有接入片段的空載體克隆PCR片段大小為：306 bp。瓊脂糖凝膠電泳（圖1）。圖1中，1＃：陰性對照（dd H2O）；2＃：自連對照（空載體自連對照組）；3＃：Mar ker：5 Kb，3 Kb，2 Kb，1．5 Kb，1 Kb，750，500，250，100 bp；4～8＃：clone1，clone 2，clone 3，clone 4，clone 5。

圖1 陽性克隆的PCR鑒定

圖2 Mmp9－sh RNA質(zhì)粒測序結(jié)果

表1 各組sh RNA序列DNA片段

圖3 RT－PCR檢測篩選最佳干擾質(zhì)粒為si R－2

圖4 Western Blot檢測篩選最佳干擾質(zhì)粒為si R－2

3 DNA測序鑒定：挑選上述陽性克隆進(jìn)行DNA序列測定，由測序結(jié)果可知Mmp9合成的雙鏈寡聚DNA插入到重組短發(fā)卡RNA載體中，成功構(gòu)建了RNA干擾慢病毒載體（圖2）。

4 RT－PCR和 Wester n－bl ot篩選、驗證最佳干擾質(zhì)粒：Mmp9－2干擾效果最好（圖3、4）。

5 慢病毒載體的包裝和滴度測定：重組p SILRFP/Mmp9－sh RNA2質(zhì)粒與慢病毒包裝系統(tǒng)其他兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞，慢病毒自動進(jìn)行包裝，48h收集到的高純度上清液，即為制備成功的p SIL－RFP/Mmp9－sh RNA2慢病毒。測定病毒滴度為1×1010pf u/L。

討 論

基質(zhì)金屬蛋白酶（Mmps）是一組鋅依賴性的肽鏈內(nèi)切酶，可以降低包括膠原、明膠、纖維連接蛋白、彈力蛋白和蛋白多糖等在內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)成分［3］，在炎癥、組織修復(fù)、腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等病理進(jìn)展的組織重構(gòu)中起著重要作用［4］。此外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)多種基質(zhì)金屬蛋白酶是血管化和腫瘤進(jìn)展中的調(diào)節(jié)因子，例如，Mmp9/gelatinase B，Mmp2/gelatinase A，Mmp3/str o melysin1 和 Mmp7/matr ylysin［5］。 其 中，Mmp9是腫瘤血管化的關(guān)鍵因素，是VEGF－VEGFR系統(tǒng)的信號［6］。國內(nèi)外大量研究證實，Mmp9與腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，并且主要是通過誘導(dǎo)血管化而發(fā)揮作用。例如，有學(xué)者報道［7］，遠(yuǎn)處原發(fā)性腫瘤肺轉(zhuǎn)移前，肺內(nèi)的Mmp9就已開始呈現(xiàn)出高表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Mmp9是通過遠(yuǎn)處原發(fā)腫瘤的VEGFR－1/Flt－1酪氨酸激酶（TK）來特異性的誘導(dǎo)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞來促進(jìn)肺轉(zhuǎn)移。

目前，針對基質(zhì)金屬蛋白酶家族開發(fā)了抑制劑，但還沒有只針對某一種Mmp的特異性抑制劑。例如，馬馬司他（Mari mastat）就是一個Mmp家族的廣譜抑制劑。它可以抑制除了 Mmp3以外的所有 Mmp［8］。但這對于我們研究某一種Mmp是不利的。相比之下，RNAi技術(shù)效率高、特異性強(qiáng)。但是，常規(guī)化學(xué)合成法合成的si RNA經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效果差，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的si RNA半衰期短，轉(zhuǎn)染率低，體外合成si RNA對基因表達(dá)的抑制作用短暫，不適合體內(nèi)實驗研究，因而使其應(yīng)用受到較大的限制。而本實驗采用體外構(gòu)建能夠表達(dá)sh RNA的慢病毒載體，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄si RNA的方法，具有可以感染非分裂細(xì)胞、目的基因整合至靶細(xì)胞基因組長期表達(dá)、免疫反應(yīng)小、轉(zhuǎn)染率高等優(yōu)勢。因而適用于體內(nèi)基因治療。

本文設(shè)計合成3對針對小鼠Mmp9基因的干擾序列，分別構(gòu)建質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞，與p SIL－RFP連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建成攜帶Mmp9－sh（AAF）等，其中DEN和 AFB1更為常用［4］。DEN為國際腫瘤研究中心機(jī)構(gòu)（International agency for research on cancer，IARC）確定的致癌物質(zhì)，對腫瘤的發(fā)生具有啟動和促進(jìn)的雙重作用。此模型特點(diǎn)為誘癌成功率高，對肝臟專一，肝細(xì)胞癌所占比例大，是迄今應(yīng)用最廣泛的一種肝癌模型［5］。常用的造模方式有口咽插管灌喂、DEN飲水等方式。后者操作簡單，不易導(dǎo)致口腔和消化道感染，不失為一種較好的造模方式。

本研究采用飼以含DEN飲水誘發(fā)的大鼠肝癌模型，并對40pp m、64pp m、80pp m三種不同濃度進(jìn)行比較，觀察發(fā)現(xiàn)第16周其病死率為0，對其進(jìn)行處死解剖，經(jīng)病理證實40pp m未見肝癌發(fā)生，64pp m、80pp m誘癌率分別為83．33%、91．66%，后續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)：第22周80pp m組成癌后大鼠出現(xiàn)4只死亡，至26周病死率為100%；而64pp m組大鼠第25周出現(xiàn)死亡，第30周病死率為100%；40pp m組第30周病死率為16．67%，處死解剖發(fā)現(xiàn)肝癌誘癌率為50%、自由飲水對照組在第30周無死亡，處死解剖未發(fā)現(xiàn)肝癌。各組大鼠所形成肝癌為肝細(xì)胞性肝癌，形成過程沒有經(jīng)過肝硬化階段，但均有程度不同的肝細(xì)胞炎癥、脂肪侵潤、纖維化情況。

本實驗提示，16周DEN64pp m、80pp m誘癌均可成功造模，80pp m組成癌后存活期僅僅只有10周，且在22周就開始出現(xiàn)死亡，若16周后開展藥物干預(yù)療程不宜超過6周，一般以4周較為科學(xué)；而64pp m組大鼠相對存活期長，藥物干預(yù)可以在10周以內(nèi)，療程可以控制在2月內(nèi)。根據(jù)成模情況和死亡時間以及存活期，我們初步認(rèn)為64pp m濃度的造模效果不亞于80pp m濃度，一定程度上64pp m似乎更優(yōu)于80pp m，因為后者出現(xiàn)巨塊型肝癌，肝癌進(jìn)展較快，相對生存期較短，不利于進(jìn)一步的藥物干預(yù)觀察，64pp m濃度誘癌是一種較理想的用于藥物療效評價的大鼠肝癌模型。

（本文圖見封3）

［1］李笑巖，白成勇．二乙基亞硝胺誘發(fā)大鼠肝癌模型的建立及病理學(xué)改變［J］．濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2007，30（6）：401－406．

［2］鄒 菁，陳建杰．補(bǔ)腎方對二乙基亞硝胺誘發(fā)大鼠肝癌的預(yù)防作用［J］．中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2003，13（5）：278－280．

［3］張 斌，李 琦．DEN誘導(dǎo)大鼠肝癌形成中mi R－199a的表達(dá)機(jī)制及健脾解毒法的干預(yù)作用［J］．世界華人消化雜志，2010 ，18（2）：125－31．

［4］吳細(xì)丕主編．實驗動物與腫瘤的研究［M］．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2000：176．

［5］Yoshiji H，Yoshii J，Ikenaka Y，et al．Inhibition of renninangtotensm system attenuates liver enzy me－altered．xt preneoplastic lesiom and fibrosis develop ment in rat［J］．J Hepatal，2002，37（1）：22－30．