湖北醫(yī)藥學(xué)院法醫(yī)學(xué)教研室 （十堰442000） 雷懷成 朱方成 魏 來(lái)

馬錢子主要藥理作用是散結(jié)消腫、通絡(luò)止痛，臨床用以治療風(fēng)濕類疾病、中風(fēng)偏癱、癡呆、視網(wǎng)膜病變以及骨傷科、腫瘤等疾病。馬錢子堿能抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，可能通過(guò)肝癌細(xì)胞FAS基因和蛋白表達(dá)增加，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡發(fā)揮抑制作用［1～3］。有研究表明，馬錢子中毒后藥物濃度在肝、腎最高。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化方法對(duì)大鼠馬錢子堿中毒后的肝臟Bcl－2和Caspase－3蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，分析肝細(xì)胞Bcl－2和Caspase－3蛋白表達(dá)的變化規(guī)律，為毒理學(xué)、法醫(yī)毒理病理學(xué)研究提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

材料與方法

1 材 料

1．1 動(dòng)物：Wistar大鼠60只（湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），雌、雄各30只，體質(zhì)量為（200±10）g。大鼠喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對(duì)照組（20只）和染毒組（40只）。采用將馬錢子堿粉劑溶解于有機(jī)溶劑后，用蒸餾水稀釋，按文獻(xiàn)［2］分別給予馬錢子堿233、300 mg∕kg一次性灌胃給藥。染毒組動(dòng)物分低、中劑量（233、300 mg∕kg）兩組，每組20只；對(duì)照組用等量無(wú)離子水灌胃，正常飲食。

1．2 主要試劑：兔抗鼠Bcl－2和Caspase－3多克隆抗體由北京中杉生物技術(shù)有限公司提供；馬錢子堿由十堰市藥品檢定所提供。

2 方 法

2．1 給藥方案：染毒組分別在染毒后1、2、3、5、7 d時(shí)，頸椎脫位處死，每次處死8只。對(duì)照組分別在灌水后1、2、3、5、7 d處死，每次處死4只。取出肝臟，矢狀位切開，用10%的甲醛固定。

2．2 染色步驟：石蠟切片 相鄰切片1/2做常規(guī)HE染色，另1/2做免疫組織化學(xué)顯色。SP法：①石蠟切片脫蠟至水；②蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min；③3%H2O2室溫孵育5～10 min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性；④5%～10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min。傾去血清，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或二抗工作液，37°C孵育1～2h；⑤滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗（1%BSA－PBS稀釋），37°C孵育10～30min；⑥ 滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根霉標(biāo)記卵蛋白，37°C孵育10～30min；⑦DAB顯色，蘇木精復(fù)染。

2．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用Leica－Q500IW圖像分析儀，將每張免疫組織化學(xué)顯色呈陽(yáng)性反應(yīng)的細(xì)胞切片在×200鏡下，隨機(jī)選擇10個(gè)視野，測(cè)量單位面積內(nèi)肝細(xì)胞呈陽(yáng)性反應(yīng)的細(xì)胞數(shù)（/mm2），結(jié)果用SPSS 10．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

結(jié) 果

1 HE染色結(jié)果 光學(xué)顯微鏡下觀察可見肝淤血，部分肝細(xì)胞濁腫；對(duì)照組未見肝細(xì)胞病理變化。

2 免疫組織化學(xué)顯色結(jié)果

2．1 Bcl－2免疫組織化學(xué)顯色：對(duì)照組肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)見少數(shù)幾個(gè)Bcl－2陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)（圖1）。染毒組胞漿質(zhì)胞核中均可見明顯棕黃色濃染；1 d組的肝細(xì)胞中，陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多（P＜0．05）。中毒2～3 d陽(yáng)性細(xì)胞達(dá)到一定峰值（圖2、3），染毒5 d組陽(yáng)性細(xì)胞逐漸減少（圖4），但至中毒后7 d，仍然可見少量的陽(yáng)性細(xì)胞。Bcl－2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見附表。

2．2 Caspse－3免疫組織化學(xué)顯色：對(duì)照組肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)未見Caspse－3陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)（圖5）。染毒后1 d組肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色濃染（圖6），3、5 d組胞質(zhì)內(nèi)棕黃色染色最濃（圖7）。染毒組在不同時(shí)間段內(nèi)肝細(xì)胞中Caspse－3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與正常對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），并且都高于正常對(duì)照組。染毒后1 d陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加，第2～3天后達(dá)到一定峰值，第5天、第7天陽(yáng)性細(xì)胞呈下降趨勢(shì)。與對(duì)照組比較，染毒1、3、5和7d差異具均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見附表。

附表 各組染毒不同時(shí)間肝細(xì)胞中Bcl－2與Caspase－3蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（，個(gè)/mm2）

附表 各組染毒不同時(shí)間肝細(xì)胞中Bcl－2與Caspase－3蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（，個(gè)/mm2）

與對(duì)照組比較，＊P＜0．05

組 別1d Bcl－2 Caspase－3 2 d Bcl－2 Caspase－3 3 d Bcl－2 Caspase－3 5 d Bcl－2 Caspase－3 7 d Bcl－2 Caspase－3對(duì)照組 2．06±0．12 1．8±0．2 1．76±0．18 1．09±0．18 0．8±0．14 0．8±0．02 0．7±0．3 0．6±0．2 0．9±0．13 0．2±0．02低濃度組 121．0±10．8＊ 147±20．6＊ 165．8±21．6＊168．2±20．8＊ 189．5±19．7＊180．6±21．7＊ 125．3±16．7＊112．2±12．6＊ 98．0±6．1＊ 94．0±8．6＊高濃度組 118．0±15．6＊152．0±21．1＊ 172．4±22．4＊174．6±19．6＊ 188．2±18．5＊189．7±20．8＊ 129．6±17．4＊118．9±13．2＊ 93．6±8．2＊ 92．8±8．9＊

討 論

馬錢子為馬錢子科植物馬錢的干燥成熟種子［4］，其成份含生物堿2%～5%，主要為番木鱉堿約1．23%、馬錢子堿約1．55%［5］。馬錢子堿是馬錢子主要成分之一，是一種弱堿性生物堿，水溶性差，作為活血通絡(luò)和“以毒攻毒”代表藥物。胡錫琴等［3，6］研究發(fā)現(xiàn)馬錢子堿在人類肝細(xì)胞癌的細(xì)胞毒性效應(yīng)最強(qiáng)，能夠引起Hep G2細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡，Caspase－9蛋白酶解增加，Hep G2細(xì)胞線粒體膜去極化而殺滅肝癌細(xì)胞，它能引起Hep G2細(xì)胞的萎縮，阻礙細(xì)胞的形成，使DNA片段斷裂，細(xì)胞循環(huán)停止，最終導(dǎo)致Hep G2細(xì)胞凋亡。其機(jī)制可能與線粒體的去極化有關(guān)。首先馬錢子堿使細(xì)胞內(nèi)的Ca2＋快速、持續(xù)地增高，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的過(guò)程；其次，B淋巴細(xì)胞也參與了整個(gè)凋亡過(guò)程，而且它的過(guò)分表達(dá)會(huì)抑制Ca2＋濃度提高。B淋巴細(xì)胞和Ca2＋介導(dǎo)的線粒體途徑最終導(dǎo)致 Hep G2細(xì)胞凋亡［7，8］。Bcl－2家族蛋白編碼兩類功能相反的蛋白質(zhì)，其中Bcl－2和Bcl－xl抑制多種刺激因素引起的細(xì)胞凋亡，而Bax和Bak則促進(jìn)細(xì)胞凋亡，甚至在某些情況下不依賴于外部刺激就足以引起細(xì)胞的死亡。Bax可通過(guò)其自身形成的Bax同二聚體和（或）與Bcl－2形成Bax－Bcl－2異二聚體發(fā)揮作用，Bax同二聚體促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bax－Bcl－2異二聚體則抑制細(xì)胞凋亡［6，9～11］。本實(shí)驗(yàn)表明，大鼠在馬錢子堿中毒后，肝細(xì)胞可表達(dá)Bcl－2，說(shuō)明馬錢子堿中毒后可能對(duì)肝組織有損害。Bcl－2表達(dá)在中毒后1d～2d內(nèi)達(dá)高峰，隨后維持一段時(shí)間后逐漸降低，但即使在中毒7d后，其表達(dá)依然顯著高于正常。這說(shuō)明Bcl－2的表達(dá)對(duì)肝細(xì)胞具有保護(hù)作用。

細(xì)胞色素C和ATP是激活細(xì)胞凋亡蛋白酶活化因子（Apaf－1）的輔助因子?；罨?Apaf－1、細(xì)胞色素C和Procaspase－9形成凋亡聚體，導(dǎo)致Caspse－3級(jí)聯(lián)效應(yīng)執(zhí)行凋亡過(guò)程。Caspase－3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，在各種原因?qū)е碌募?xì)胞凋亡過(guò)程中，Caspase－3的作用必不可少［12～14］。在治療各種疾病和抗腫瘤過(guò)程中，馬錢子堿在肝的濃度最高，可能會(huì)引起部分正常的肝細(xì)胞發(fā)生病理生理和形態(tài)學(xué)變化；本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，大鼠在馬錢子堿中毒1 d后肝細(xì)胞中Caspase－3即出現(xiàn)陽(yáng)性蛋白表達(dá)，在中毒2～3 d內(nèi)達(dá)高峰，維持一定峰值后逐漸降低，但在中毒7 d后，其表達(dá)依然高于正常對(duì)照組，而低、中濃度染毒組之間無(wú)差異。說(shuō)明大鼠在馬錢子中毒后肝細(xì)胞可能存在少量的細(xì)胞凋亡。各種應(yīng)激源作用于機(jī)體后，通過(guò)不同的受體傳入細(xì)胞內(nèi)，觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列生化改變，引起細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的激活，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，這是一個(gè)復(fù)雜的生理和病理過(guò)程［14，15］。說(shuō)明馬錢子堿中毒對(duì)肝細(xì)胞產(chǎn)生了損害，機(jī)體在有害因素作用下啟動(dòng)一系列應(yīng)激反應(yīng)。中毒發(fā)生后，凋亡抑制基因啟動(dòng)較快，保護(hù)細(xì)胞免于凋亡。本實(shí)驗(yàn)顯示，促凋亡基因的表達(dá)雖然啟動(dòng)較緩慢，但啟動(dòng)后逐漸上升，并在較長(zhǎng)時(shí)間保持較高水平的表達(dá)，持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)［16，17］。

實(shí)驗(yàn)中，中毒組大鼠的肝細(xì)胞Bcl－2和Caspase－3表達(dá)的時(shí)間均較長(zhǎng)，說(shuō)明馬錢子堿在肝內(nèi)代謝過(guò)程中，可能對(duì)部分肝細(xì)胞造成了損害。推測(cè)馬錢子堿可能致肝細(xì)胞線粒體發(fā)生形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，特別是線粒體膜電位及膜結(jié)構(gòu)改變，引起肝細(xì)胞有氧呼吸障礙，激發(fā)肝細(xì)胞的應(yīng)激狀態(tài)，誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡發(fā)生。這一過(guò)程又激發(fā)了Caspase－3基因促進(jìn)細(xì)胞凋亡。隨著馬錢子堿作用逐漸減弱，凋亡誘導(dǎo)因素逐漸減低，肝細(xì)胞凋亡終止。馬錢子堿中毒后的肝細(xì)胞出現(xiàn)Bcl－2和Caspase－3表達(dá)提示其參與了病理生理過(guò)程，但有待進(jìn)一步研究、探討。

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