楊 洋，劉 軍，趙 娜，季 楠，曹雅明，王繼春*

(1.中國醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病原生物學教研室，遼寧沈陽 110001;2.中國醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院免疫學教研室，遼寧沈陽 110001)

蠕蟲分布廣泛，種類繁多，發(fā)育周期復雜多樣，通過侵入不同的器官系統(tǒng)，經(jīng)過復雜的移行途徑最終進入宿主的寄生部位。人體的絕大多數(shù)器官甚至組織都是蠕蟲潛在的感染目標。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，全世界有1億以上的人患有長期的蠕蟲感染。在熱帶和亞熱帶地區(qū)，蠕蟲感染屬于最常見的慢性感染性疾病，而瘧疾作為危害人類最嚴重、致死率最高的寄生原蟲性疾病，其地理分布與蠕蟲感染疾病相似，因此混合感染十分常見［1-2］。2009年Hoeve MA等［3］在研究同時感染巴西日圓線蟲(Nippostrongylus brasiliensis)和夏氏瘧原蟲(Plasmodiun chabaudi)的BALB/c小鼠模型時，發(fā)現(xiàn)混合感染使小鼠抵御瘧原蟲攻擊感染的能力增強。雖然瘧疾和蠕蟲病各自具有獨特的傳播手段，但不同的環(huán)境和宿主因素都會影響感染和疾病的發(fā)生。因此，蠕蟲感染對瘧原蟲感染的發(fā)生、發(fā)展乃至轉(zhuǎn)歸的影響仍是具有意義的研究課題。旋毛形線蟲是一種具有獨特發(fā)育周期的生物源性蠕蟲，其成蟲寄生在宿主小腸，而作為主要致病階段的幼蟲則寄生在同一宿主的橫紋肌細胞內(nèi)。因此，該蟲種兼具腸道寄生線蟲和組織寄生線蟲的特征。然而，關(guān)于旋毛形線蟲感染對瘧疾感染進程和結(jié)局的影響及其相關(guān)機制尚不明確。因此，探討旋毛形線蟲與瘧原蟲之間的相互作用特點，特別是對瘧疾免疫應答的影響及其相關(guān)機制，無疑可進一步充實對瘧疾免疫的認識，并將為揭示瘧疾流行區(qū)病原體相互作用的相關(guān)機制提供新的理論依據(jù)。本研究用旋毛形線蟲小鼠模型再感染瘧原蟲，觀察混合感染后小鼠抵御瘧原蟲攻擊感染的能力，以期揭示旋毛形線蟲與瘧原蟲共同感染的相關(guān)免疫學機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物、瘧原蟲 6～8周齡 BALB/c雄性小鼠購自中國醫(yī)科大學實驗動物中心;夏氏瘧原蟲(P.c chabaudiAS)由中國醫(yī)科大學免疫學教研室饋贈;旋毛形線蟲由大連醫(yī)科大學寄生蟲學教研室饋贈。

1.1.2 主要試劑 Trizol，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)公司。

1.1.3 主要儀器 PCR儀，TaKaRa公司，日本;熒光定量PCR儀，AB公司，英國。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物混合感染模型制備 24只小鼠隨機分為3組，每組8只，每只小鼠經(jīng)口感染300只旋毛形肌幼蟲，并分別于感染后的1 w(TPC1)、3 w(TPC3)經(jīng)腹腔感染1×106夏氏瘧原蟲寄生的紅細胞，構(gòu)建混合感染模型。對照組(PC)在同一時間點單純感染夏氏瘧原蟲。

1.2.2 原蟲血癥檢測及體重觀察 混合感染模型制備成功后，每天隨機取3只小鼠，經(jīng)尾靜脈采血，制備薄血膜，Giemsa染色，顯微鏡檢計數(shù)紅細胞感染率并記錄小鼠體重變化。

1.2.3 RNA提取及cDNA合成 檢測出原蟲血癥當天無菌取小鼠脾臟，取50～100 mg組織加入1 mL Trizol試劑，用氯仿法提取脾臟RNA，用紫外分光光度計測定RNA的含量，剩余脾臟置－70℃保存。用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，置－20℃保存。

1.2.4 引物設計 在 GenBank中查找 Gata-3(Th2轉(zhuǎn)錄因子)，T-bet(Th1轉(zhuǎn)錄因子)以及GAPDH基因(管家基因)序列，通過Primer 5.0在線軟件設計實時定量PCR引物(見表1)，引物由華大基因公司合成。

表1 Gata-3，T-bet以及GAPDH引物序列Table1 Sequences of Gata-3，T-bet and GAPDH primers

1.2.5 熒光定量PCR檢測T-bet及Gata-3 mRNA表達水平 利用SYBR GreenⅡ染料進行各基因的實時熒光定量PCR檢測，反應體系(共20 μL):SYBR Premix 10 μL，RoxⅡ 0.4 μL，上、下游引物各1.6 μL，模板2.0 μL，ddH2O 4.4 μL。反應條件:95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個循環(huán)。為消除樣本處理、反轉(zhuǎn)錄反應差異，每個樣品GAPDH、Gata-3及T-bet基因同時檢測3次，取平均值。

1.2.6 統(tǒng)計學分析 運用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理，采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合感染模型的鑒定

旋毛蟲肌幼蟲感染后8 w將小鼠引頸處死，取一小塊膈肌壓片鏡檢觀察，證實小鼠均成功感染旋毛蟲(圖1)。

圖1 膈肌壓片(40×)Fig.1 Diaphragmatic tablet(40×)

圖2 小鼠感染后不同時間原蟲血癥水平及體重變化Fig.2 The parasitemia and weight of mice at different time points after infection

2.2 原蟲血癥檢測及體重觀察

旋毛蟲預感染1 w實驗組與對照組相比，感染后第5天，小鼠的外周血中出現(xiàn)瘧原蟲感染的紅細胞，原蟲血癥水平至感染后11天達到峰值后迅速下降，對照組峰值為40.2%，預感染1 w實驗組為36.4%(峰值降低)。預感染3 w實驗組于感染后第7天檢測出原蟲血癥，原蟲血癥出現(xiàn)時間推遲，至感染后15天達到峰值44.5%(峰值升高)，實驗組與對照組皆于感染后25天左右自愈(圖2a、2b)。實驗組與對照組相比體重均下降(圖2c、2d)。

2.3 T-bet及Gata-3 mRNA表達水平

旋毛蟲預感染1 w實驗組T-bet相對表達量為1.94±0.16，Gata-3相對表達量為0.49±0.13;旋毛蟲預感染3 w實驗組T-bet相對表達量為0.35±0.11，Gata-3相對表達量為2.45±0.26。與對照組相比，旋毛蟲預感染1 w實驗組T-bet表達水平升高，Gata-3表達水平降低;旋毛蟲預感染3 w實驗組Gata-3表達水平升高，T-bet表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(圖3a，3b)。

圖3 T-bet及Gata-3的表達水平Fig.3 The expression of T-bet and Gata-3

3 討論

瘧疾是一類高發(fā)病率、高死亡率的疾病，瘧原蟲與蠕蟲的混合感染可以引起對立或協(xié)調(diào)的相互作用而使疾病難以控制。近年來，探討瘧疾流行區(qū)不同病原體之間的相互作用特點，特別是其他病原體對瘧疾免疫應答的影響及其相關(guān)機制備受關(guān)注。在夏氏瘧原蟲感染鼠瘧模型中，紅內(nèi)期瘧原蟲的免疫應答為最初的適應性免疫應答，要求Th1細胞活化效應細胞(如巨噬細胞)，遏制瘧原蟲的爆發(fā)性增殖，隨后進一步轉(zhuǎn)化為Th2細胞因子和抗體的產(chǎn)生，以徹底清除寄生蟲，防止復發(fā)和再燃［4-6］。Th1細胞應答的適當建立和隨后Th2細胞因子輔助B細胞產(chǎn)生抗體對控制和清除原蟲血癥至關(guān)重要，明顯影響著感染進程和感染結(jié)局［7］。免疫系統(tǒng)中Th1/Th2的分化路徑主要是由其上游的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。近年來研究發(fā)現(xiàn)分別表達于Th1和Th2細胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子T-bet和Gata-3基因具有重要的調(diào)節(jié)功能，最終決定Th0向Th1/Th2的分化［8］。而Th1和Th2的活性程度可以間接反應兩種免疫系統(tǒng)參與免疫反應與調(diào)控的狀態(tài)。本實驗通過選擇性觀察主要轉(zhuǎn)錄因子T-bet及Gata-3 mRNA在檢測出原蟲血癥當天的變化，發(fā)現(xiàn)預感染旋毛形線蟲1 w時誘導以Th1激活為主的免疫狀態(tài)，而預感染旋毛形線蟲3 w時誘導以Th2激活為主的免疫狀態(tài)。

新生幼蟲是旋毛形線蟲整個生活史中唯一由腸黏膜進入血液、淋巴液中移行而不寄生于宿主細胞內(nèi)的發(fā)育階段，新生幼蟲抗原具有較好的免疫原性，能刺激機體發(fā)生強烈的免疫應答，誘導機體產(chǎn)生有效的體液免疫和細胞免疫，是宿主免疫針對的主要靶期［9］。而細胞免疫是宿主自然感染旋毛形線蟲后破壞新生幼蟲的主要抵制機制之一［10］。旋毛形線蟲對瘧原蟲混合感染的影響及其相關(guān)機制鮮有研究，僅Ngwenya發(fā)現(xiàn)旋毛形線蟲預感染可增強宿主對致死型柏氏瘧原蟲(P.bergheiNYU-2)的抗感染能力。研究發(fā)現(xiàn)旋毛形線蟲預感染1w時CD8+T細胞增多，活化的CD8+T細胞主要具有殺傷活性。單核巨噬細胞系統(tǒng)激活，中性粒細胞、巨噬細胞、肥大細胞與嗜酸性粒細胞共同參與殺傷作用。抑制血紅蛋白的產(chǎn)生，導致宿主貧血，原蟲血癥水平降低。旋毛形線蟲預感染3 w時，旋毛形線蟲為幼蟲移形期，穿破各臟器毛細血管，此時貧血癥狀最嚴重。本實驗以非致死型夏氏瘧原蟲為研究對象，根據(jù)以往的研究結(jié)論及本實驗發(fā)現(xiàn)旋毛形線蟲預感染1 w時，誘導宿主以Th1激活為主的免疫狀態(tài)，單核巨噬細胞系統(tǒng)激活，抑制血紅蛋白的合成，原蟲血癥峰值降低。預感染旋毛形線蟲3 w時，誘導宿主以Th2激活為主的免疫狀態(tài)，此時宿主貧血癥狀最嚴重，原蟲血癥出現(xiàn)時間推遲，原蟲血癥峰值升高，但是混合感染并不影響宿主最終清除瘧原蟲的能力，可能與Treg免疫反應的調(diào)節(jié)機制相關(guān)。一般來說，瘧疾和土源性蠕蟲病會造成宿主的體重降低的狀況，這種現(xiàn)象在同時感染瘧原蟲和土源性蠕蟲時表現(xiàn)突出。與對照組相比，預感染旋毛形線蟲1 w、3 w的實驗組體重均下降。

本研究首次表明在夏氏瘧原蟲感染早期，預感染旋毛形線蟲1 w、3 w的小鼠對瘧原蟲的抗感染能力增強，研究結(jié)果證明Th細胞在瘧疾感染早期免疫調(diào)控中的重要作用。本實驗進一步充實對瘧疾免疫的認識，為人類對抗瘧原蟲感染提供了新的研究思路。

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