孫翠煥，冀寶營，朱巍巍，王艷華，朱萬芹

(遼寧省微生物科學研究院，遼寧朝陽 122000)

藏靈菇也稱雪蓮花，是流傳在民間的家庭制作酸奶用菌種。它是一種乳白色、膠質(zhì)狀的塊狀物，有一定彈性，菌塊外部形成多數(shù)米粒狀，菌塊在牛乳中隨著培養(yǎng)時間及傳代次數(shù)增多會逐漸生長，分割后放入乳中培養(yǎng)，生長特性不改變［1］。藏靈菇是由多種微生物共生形成的一種菌團，與國外研究較多的開菲爾粒類似。菌塊上棲息的微生物有乳酸菌、酵母菌、醋酸菌［2］，在發(fā)酵牛乳時，除生成大量的有機酸和少量乙醇外，還有其他豐富的生物活性物質(zhì)，營養(yǎng)價值較高。據(jù)文獻記載，藏靈菇具有反抗炎作用［3］，其發(fā)酵產(chǎn)物可加速唾液、胃酶及胰酶分泌;產(chǎn)生的乳酸、醋酸及抗菌物質(zhì)可抑制小腸中的腐敗微生物生長，抗菌物質(zhì)還能抑制癌細胞的生成及增殖;發(fā)酵產(chǎn)生的微量乙醇可以促進新陳代謝［4］。相關(guān)研究顯示［2］，根據(jù)藏靈菇來源不同，其中菌群會有差異，以乳酸球菌為例，可歸為5個種屬，分別為糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、堅強腸球菌、乳酸乳球菌乳脂亞種、假腸膜明串珠菌、類腸膜明串珠菌。糞腸球菌是人和動物腸道中的正常棲生菌，已有作為益生菌使用先例。糞腸球菌能利用多種糖發(fā)酵產(chǎn)酸，在國外已應用到干酪的成熟中;瑞典公司將糞腸球菌與長雙歧桿菌混合制成膠囊;作為保健藥品，我國農(nóng)業(yè)部允許使用糞腸球菌用于飼料添加劑中，國內(nèi)也有把糞腸球菌用于人用口服液的研究報道。但研究中發(fā)現(xiàn)，自藏靈菇中分離的糞腸球菌產(chǎn)生的蛋白酶具有低溫蛋白酶的特征［5］。目前應用最多的生產(chǎn)蛋白酶的細菌是枯草芽胞桿菌，其他細菌因產(chǎn)酶能力低，研究較少，尤其是乳酸菌。本文對藏靈菇中糞腸球菌的分離及鑒定作一報道，為其進一步研究與開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 藏靈菇:本實驗室收藏，用于家庭制作酸奶。

1.1.2 培養(yǎng)基 增殖及菌種保藏培養(yǎng)基:12%復原脫脂乳;分離培養(yǎng)［6］:酸化MRS培養(yǎng)基(調(diào)整pH值為5.4);M17培養(yǎng)基;改良TJA培養(yǎng)基。

1.1.3 儀器設備 超凈工作臺;CO2培養(yǎng)箱;恒溫培養(yǎng)箱;液體混合振蕩器;高壓滅菌鍋;顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化與擴增 用無菌水沖洗藏靈菇后，按2%(質(zhì)量體積比)的比例接種到12%復原脫脂乳中，30℃培養(yǎng)24 h，過濾出藏靈菇，如此連續(xù)活化3次，第3次發(fā)酵乳備用。顯微鏡觀察菌體生長情況。

1.2.2 菌種的分離、純化及鑒定［7-9］①無菌吸取活化擴增后的藏靈菇發(fā)酵乳1 mL，用無菌生理鹽水稀釋，在液體混合器上振蕩10 min，使菌體分散。以10倍稀釋法稀釋至10－6、10－72個稀釋度，取稀釋液 0.1 mL，分別涂布于酸化 MRS、M17、改良TJA培養(yǎng)基上，平板倒置，調(diào)整10%CO2濃度，37℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，觀察菌落生長情況及菌體形態(tài)。挑選典型菌落進行革蘭染色，把革蘭染色陽性菌株在改良TJA培養(yǎng)基上劃線，37℃恒溫有氧培養(yǎng)，進行純化。同時驗證菌株耐氧性;②糞腸球菌的生理生化鑒定:過氧化氫酶測定:挑取純化平板上單菌落，涂于干凈的載玻片上，然后在上面加1滴3%～15%H2O2，如果有氣泡產(chǎn)生則為陽性反應，無氣泡為陰性反應。石蕊牛乳的培養(yǎng)試驗:挑取純化平板上單菌落，轉(zhuǎn)至含有10 mL滅菌脫脂石蕊牛乳的試管中，37℃恒溫培養(yǎng)6～12 h，觀察狀態(tài)變化。出現(xiàn)均勻的凝乳狀態(tài)，顏色為粉紅色，無氣泡產(chǎn)生的現(xiàn)象為陽性反應。乳酸發(fā)酵的檢測試驗:采用紙層析法檢驗發(fā)酵過程中乳酸的生成情況。展開劑:水∶苯甲醇∶正丁醇以1∶5∶5的量相混合，然后加1%的甲酸。顯色劑:0.04%的溴酚藍乙醇溶液，用0.1 mol/L的NaOH調(diào)pH至6.7。以2%的乳酸和不接種培養(yǎng)液樣品為對照。顯色后與對照比較，觀察在對應位置是否出現(xiàn)黃色斑點，以確定是否有乳酸生成。其他鑒定方法依據(jù)參考文獻［7］進行。其中碳水化合物試驗采用配制好的商品細菌生化微量鑒定管，酸的產(chǎn)生可以利用預先加入到培養(yǎng)基的溴甲酚紫指示劑來斷定。37℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察各管中液體顏色變化情況，當發(fā)酵產(chǎn)酸時，可使培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色，為陽性，反之陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 藏靈菇發(fā)酵乳中菌株形態(tài)觀察

顯微觀察藏靈菇發(fā)酵乳中酵母菌6 μm×10 μm、球菌直徑0.6 μm、桿菌0.3 μm×5 μm 和0.4 μm×9 μm。

2.2 菌種的分離、純化及形態(tài)學、生理生化特性研究［10］

由于分離的菌株在復原乳中保藏，只有球菌出現(xiàn)胨化現(xiàn)象，因此本文只對球菌的研究做一報道。

2.2.1 菌株分離 分離培養(yǎng)基平板上的球菌菌落生長情況及菌體革蘭染色、鏡檢情況見表1。

表1 分離培養(yǎng)情況表Table1 The table for isolation and culture

在分離及純化培養(yǎng)中，球菌在10%CO2濃度及有氧條件下均能正常生長。分離培養(yǎng)基中球菌菌落形態(tài)及菌體形態(tài)見圖1及圖2。

圖1 分離培養(yǎng)基中球菌菌落形態(tài)Fig.1 Morphology of aureus colony in medium of isolation and culture

圖2 菌體形態(tài)Fig.2 Morphology of thallus

2.2.2 乳酸菌的初步鑒定 將純化后的球菌編號為RQ15，進行過氧化氫酶測定、石蕊牛乳培養(yǎng)試驗及乳酸發(fā)酵試驗。結(jié)果為過氧化氫酶陰性、乳酸發(fā)酵陽性、石蕊牛乳反應陽性。初步鑒定結(jié)果為自藏靈菇中分離的球菌為乳酸球菌。從實驗看出，酸化MRS培養(yǎng)基一般情況可分離乳酸桿菌，本次分離時乳酸球菌生長，說明該球菌在較低pH下能生長，以后在該菌株的生長及發(fā)酵特性實驗時再進一步研究。

2.2.3 乳酸球菌的生理生化特性研究 將純化培養(yǎng)基上的RQ15單菌落轉(zhuǎn)接入12%無菌復原脫脂乳中，37℃培養(yǎng)至凝乳，冰箱冷藏備用。RQ15在延時培養(yǎng)及在冷藏保存過程中出現(xiàn)胨化現(xiàn)象，蛋白被降解，見圖3。從胨化現(xiàn)象分析，RQ15有產(chǎn)低溫蛋白酶的可能，將進一步研究進行證實。

圖3 RQ15脫脂乳培養(yǎng)物胨化現(xiàn)象Fig.3 Peptone phenomenon in defatted milk culture of RQ15

通過PYR陽性、過氧化氫酶測定、硫化氫的產(chǎn)生、吲哚試驗、硝酸鹽還原試驗均為陰性，不能液化明膠、葡萄糖發(fā)酵不產(chǎn)氣，并通過RQ15的培養(yǎng)特性試驗，在10℃和45℃生長，60℃ 30 min、pH 9.6和6.5%NaCl中均生長，初步鑒定為腸球菌屬(Enterococcus Thiercelin and Jouhaud)。通過碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸試驗結(jié)果，初步鑒定RQ15為糞腸球菌(Enterococcus faecalis)。碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸試驗結(jié)果見表2及圖4。

表2 RQ15碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸試驗情況表Table2 The acids produced by the carbohydrate fermentation of RQ15

圖4 RQ15的碳水化合物發(fā)酵試驗Fig.4 Test of the carbohydrate fermentation of RQ15

2.2.4 糞腸球菌的生物學鑒定 通過寶生物工程(大連)有限公司對RQ15進行了分子生物學鑒定，結(jié)果為RQ15為糞腸球菌(Enterococcus faecalis)，編號E.faecalisRQ15。E.faecalisRQ15的16S rRNA序列在 GenBank的檢索號為GU373724，與之相近菌株中未見關(guān)于蛋白酶研究和應用的信息。通過對該菌株產(chǎn)酶進行純化和酶學性質(zhì)分析，證明了該菌株產(chǎn)酶具有低溫蛋白酶的特征［5］，另文報道。

3 討論

藏靈菇富集了多種對人體有益的微生物，通過有氧與厭氧相結(jié)合的分離方式，利用分離乳酸菌檢出率較高的3種培養(yǎng)基，從藏靈菇中分離到1株球菌RQ15。通過對分離到的RQ15進行形態(tài)學及生理生化特性研究，并通過分子生物學手段，鑒定RQ15為糞腸球菌。研究發(fā)現(xiàn)，E.faecalisRQ15在12%復原脫脂乳中延時培養(yǎng)及冷藏保存時，能使蛋白質(zhì)降解，分析RQ15可能在不同溫度范圍內(nèi)尤其是在低溫下能產(chǎn)生蛋白酶。因此，后續(xù)的產(chǎn)酶及酶學性質(zhì)研究中［5］，證實了E.faecalisRQ15產(chǎn)低溫中性蛋白酶的可能，SDS-PAGE測定該蛋白酶分子質(zhì)量為32.4 ku，最適作用溫度35～40℃，最適pH 7.5。20～40℃之間酶活較高，pH值耐受范圍廣泛，具有低溫蛋白酶的特征。

低溫蛋白酶具有反應溫度低、對熱敏感的特點，所以在飼用、食品、日用品和污水處理等方面有其他蛋白酶無法比擬的優(yōu)勢。糞腸球菌是人體腸道正常棲生菌，雖然目前國內(nèi)還沒有允許使用活菌體直接用于人體，但國外已有用于食品及保健品的先例，利用E.faecalisRQ15進行降解蛋白生產(chǎn)多肽類產(chǎn)品，滅活后作為普通食品或生產(chǎn)保健品、化妝品等，是可行的。因此，E.faecalisRQ15作為食源性菌株，所產(chǎn)的蛋白酶在飼料、食品、化妝品及酶制劑領(lǐng)域的開發(fā)應用有著較好的前景。

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