張小燕

(重慶師范大學生命科學學院，重慶 401331)

菌根(Mycorrhiza)是真菌與植物的共生聯(lián)合體，1885年Frank就描述了真菌與植物的這種共生關系并提出了“菌根”這一名詞。外生菌根又稱菌套菌根，是由外生菌根真菌侵染植物營養(yǎng)根的表面而形成的。外生菌根多形成于木本植物，大多為森林喬木如松科、樺木科、柏科和樟科等。菌根真菌同其他微生物一樣有營養(yǎng)要求，現(xiàn)在已經(jīng)實現(xiàn)了對部分外生菌根真菌的純培養(yǎng)研究，其生長生理也得到了較詳細的研究。早在1894年Frank就提出外生菌根能夠吸收利用土壤中的氮［1］。Martin和Botton［2］報道，與外生菌根真菌形成共生體之后，五針松(Pinus strobes)氮、磷、鉀養(yǎng)分的吸收量明顯增加。迄今為止，人們對外生菌根真菌及外生菌根活化和吸收磷的作用機理及其影響因素已作了大量研究，科研工作者常常把外生菌根促進植物生長的作用歸結(jié)于它們促進了磷的吸收。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 試驗選用彩色豆馬勃(Pisolithus tinctorius715)，1996年從四川西昌的桉樹林紅壤中分離獲得，屬于擔子菌門、腹菌類、硬馬勃目、豆馬勃屬;松乳菇(Lactarius deliciosus)(2002年10月從重慶市三峽庫區(qū)天然林采集子實體分離獲得，屬于擔子菌門、傘菌目、紅菇科、乳菇屬)的3個株系均由西南大學資源環(huán)境學院黃建國教授提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 Pachlewski培養(yǎng)基(g/L):酒石酸銨0.5，磷酸二氫鉀1.0，MgSO4·7H2O 0.5，麥芽糖5，葡萄糖20，維生素B10.1×10－3、瓊脂20及1 mL微量元素混合液(每升混合液內(nèi)含H3BO38.5 mg，MnSO45 mg，F(xiàn)eSO46 mg，CuSO40.625 mg，(NH4)2MoO42.77 mg)。

1.2 方法

1.2.1 生物量 過濾收集獲得的菌絲體，用去離子水小心沖洗干凈、烘干((80±2)℃，6 h)、稱量。

1.2.2 濾液中氮濃度的測定 銨態(tài)氮:靛酚藍比色法;硝態(tài)氮:酚二磺酸比色法;谷氨酸態(tài)氮:茚三酮比色法。菌絲體含氮量以培養(yǎng)液中初始氮的濃度減去接種真菌后的剩余氮的濃度的差值與其生物量的比值來計算。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 利用Excel、DPS和SINGMAPLOT的統(tǒng)計工具對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計作圖分析，顯著水平設為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 外生菌根真菌的氮營養(yǎng)吸收特性

2.1.1 不同氮源對外生菌根真菌生長的影響培養(yǎng)液中營養(yǎng)元素的不同形態(tài)對外生菌根真菌純培養(yǎng)的影響，因菌種的不同而異，有的在無機營養(yǎng)中生長較快，而有的在有機營養(yǎng)中長勢較好。由圖1可見，外生菌根真菌的生長量因培養(yǎng)液中的氮源和菌種的種類不同而不同。彩色豆馬勃Pt 715和松乳菇Ld-3在3種氮源上的生物量無顯著差異，變化于101.7～146.3 mg/bottle之間，表現(xiàn)出對3種氮源無偏好性;Ld-1在NO3－-N上的長勢明顯好于在 NH4+-N和Glu-N，并且在 NO3－-N上的生物量是其在NH4+-N和 Glu-N上的兩倍多;而 Ld-2在NO3－-N和Glu-N上均生長的較好，顯著強于含NH4+-N的培養(yǎng)液。

圖1 不同氮源對外生菌根真菌生長的影響Fig.1 Effect of nitrogen source on the growth of ectomycorrhizal fungi

2.1.2 不同氮源對外生菌根真菌菌絲含氮量的影響 圖2是在不同氮源條件下，外生菌根真菌的菌絲體含氮量。

圖2 不同氮源對外生菌根真菌含氮量的影響Fig.2 Effect of nitrogen source on the nitrogen conceration by ectomycorrhizal fungi

2.1.3 不同氮源對外生菌根真菌吸氮量的影響

吸氮量是菌絲的生物量和含氮量的乘積，結(jié)果表明Pt 715、Ld-1和Ld-3對3種氮源的吸收量順序都為對的吸收最好，要顯著高于和Glu-N(圖3)?？偟膩碚f，Ld-2和Ld-3對3種氮素的吸收要好于Ld-1，Ld-1對的吸收最好為5.591 6 mg/bottle而對Glu-N的吸收只有2.094 8 mg/bottle，是供試菌株中吸氮量最少的;Ld-2對的吸收比對和Glu-N增加14.2%，其對和Glu-N的吸收利用無顯著差異;Ld-3菌絲體吸氮范圍變化于6.548 3～7.718 3 mg/bottle之間，其中對的吸收最好。根據(jù)本實驗結(jié)果Pt 715比較適合于在上生長，其對的吸收利用效率最高為7.784 6 mg/bottle，這與前人的研究結(jié)果是一致的。

圖3 不同氮源對外生菌根真菌吸氮量的影響Fig.3 Effect of nitrogen source on the nitrogen absorption by ectomycorrhizal fungi

2.2 外生菌根真菌吸收氮的動力學研究

如前所述，高等植物和外生菌根真菌吸收養(yǎng)分符合Michaelis-Menten酶動力學方程。本實驗對松乳菇的3個株系進行了動力學研究，建立了相關的動力學曲線(圖4、5、6)。

圖4 外生菌根真菌Ld-1的氮素吸附動力圖Fig.4 Kinetic curve of nitrogen absorption by ectomycorrhizal fungus Ld-1

圖5 外生菌根真菌Ld-2的氮素吸附動力圖Fig.5 Kinetic curve of nitrogen absorption by ectomycorrhizal fungus Ld-2

圖6 外生菌根真菌Ld-3的氮素吸附動力圖Fig.6 Kinetic curve of nitrogen absorption by ectomycorrhizal fungus Ld-3

根據(jù)以上動力學曲線以及相應的動力學方程可以得出動力學常數(shù)(Imax、Km和Cmin)(表1)。

表1 外生菌根真菌吸收氮的動力學常數(shù)(mmol/L)Table1 Kinetic parameters of nitrogen nitrition+absorption by ectomycorrhizal fungi

實驗結(jié)果表明，不同外生菌根真菌吸收氮素的動力學參數(shù)差異很大(表1)。對NH4+-N來說，3個菌株的Km值變化范圍在21.88～24.80 μmol/L之間，其中Ld-2最大，Ld-3最小，表明不同外生菌根真菌吸氮位點與的親和力不同，Ld-3吸氮位點與的親和力最好，Ld-2吸氮位點與的親和力最差;Imax為85.73～122.86 μmol/(g·dw)/h，Ld-3最大，Ld-2和Ld-1間無顯著差異，即外生菌根真菌Ld-3對的吸收速率最大;Cmin為0.52～0.55 μmol/L，3個菌株間無顯著差異，即菌株從外界吸收的最低濃度相似。

統(tǒng)計分析表明，Ld-3對2種氮源的Km和Cmin值最小，此菌株能適應低養(yǎng)分的土壤環(huán)境，并且是松乳菇株系中一種高效的吸收NH4+-N和Glu-N的菌株。

3 討論

3.1 外生菌根真菌的氮營養(yǎng)吸收特征

試驗發(fā)現(xiàn)供試4種外生菌根真菌在3種形態(tài)的氮素培養(yǎng)基上生長良好，培養(yǎng)2～3周后其生物量都在100 mg以上，最高可達349.6 mg，說明供試菌株對氮素營養(yǎng)的適應性很強。但是，外生菌根真菌在不同的氮源上生長因菌種的不同而有差異，Ld-1在培養(yǎng)基上生長勢最好;Ld-2在和Glu-N上生長較好;Pt 715和Ld-3對3種氮源的培養(yǎng)基上無顯著差異，對Pt 715的研究結(jié)果與Smith R.A的報道一致［3-4］。

供試菌株均能很好地吸收3種氮源，其中Pt 715的優(yōu)勢氮源為和Ld-3的優(yōu)勢氮源為。但它們吸收利用氮素營養(yǎng)的機理尚不清楚，在氮素利用的過程中，有關酶類(硝酸還原酶、磷酸酶和脲酶等)起重要作用，尚需深入研究。

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，以及對化學肥料存在的環(huán)境危害性的認識等原因，生物肥料正在日益受到重視。國內(nèi)外已經(jīng)有很多科研人員開發(fā)出菌肥產(chǎn)品，菌根菌劑的研究也正為人們所熟悉。因此本試驗研究結(jié)果還為菌根菌劑的生產(chǎn)提供充分的理論依據(jù)，為以獲得營養(yǎng)體為目的的外生菌根真菌培養(yǎng)體系的建立打下了基礎。

3.2 外生菌根真菌的氮營養(yǎng)吸收機理探討

研究表明，高等植物和外生菌根真菌吸收養(yǎng)分符合Michaelis-Menten酶動力學方程，研究外生菌根真菌吸收氮營養(yǎng)的動力學可以了解外生菌根吸收氮的效率，并探索它們高效吸收氮營養(yǎng)的機理，指示它們適宜生長的土壤條件，并篩選出高效吸收養(yǎng)分的菌根真菌的株系。

土壤中氮素的形態(tài)和含量受自然因素(氣候、環(huán)境、地形及植被)和農(nóng)業(yè)措施(耕作、施肥、灌溉及利用方式)的影響，變異性很大。土壤中的氮素大多數(shù)以有機氮的形態(tài)存在，無機氮僅占土壤總氮的1%，而被植物吸收利用的主要是無機氮(銨態(tài)氮和硝態(tài)氮)。不同性質(zhì)的土壤中無機態(tài)氮的含量也有很大的差異，如酸性土壤含量要多一些，而堿性土壤中含量要多一些［5］。在我國西部地區(qū)很多荒山荒地需要通過植被來恢復，但這些地區(qū)的營養(yǎng)元素非常貧瘠。因此對外生菌根真菌吸附氮素的動力學進行探討研究有利于推動菌根技術的廣泛應用，從而因地制宜地選擇優(yōu)良的菌種進行植樹造林，造福人類，美化環(huán)境。

本試驗供試菌株對外界環(huán)境中的氮素吸附的最小濃度在0.52～0.82 μg/L之間，這要遠遠小于土壤中氮的濃度，因此供試外生菌根真菌在極其貧瘠的土壤中都能有效地吸收氮。統(tǒng)計分析表明，Ld-3對和Glu-N 2種氮源的Km和Cmin值最小，此菌株能適應低養(yǎng)分的土壤環(huán)境，是松乳菇株系中一種高效吸氮的菌株可將之應用到相應的低養(yǎng)分土壤中。但是由于某些外生菌根真菌在共生狀態(tài)下和離體培養(yǎng)時其生物學特性存在很大的差異，所以對共生狀態(tài)下的特性狀況有待于進一步研究探討。

植物根系養(yǎng)分吸收的動力學研究在植物的礦質(zhì)營養(yǎng)中占有重要地位，早在20世紀50年代初期Epstein和Hagen［6］就開始研究根對離子的吸收動力學。根系養(yǎng)分吸收動力學研究為闡明養(yǎng)分吸收特性、鑒定和篩選養(yǎng)分高效吸收的基因型提供了有利的手段，但是動力學參數(shù)并非恒定的參數(shù)，對于既定的養(yǎng)分離子來說它隨植物種類不同、品種不同、苗齡不同、營養(yǎng)狀態(tài)的不同而發(fā)生變化。至今，小麥、大麥、玉米、豆科植物、水稻等對N、P、K、Ca、Mg等的吸收動力學已得到深入研究，而對森林喬木的研究少有報道［7-12］。根據(jù)現(xiàn)有的研究報道，養(yǎng)分供應狀態(tài)也會影響植物根系吸收動力學的參數(shù)，據(jù) Drew［10］報道，缺P培養(yǎng)4 d或更多天可使大麥的Imax值增加4倍，而Km值不變。外生菌根真菌能促進寄主植物對養(yǎng)分元素的吸收，因此可以推測菌根的形成也會影響寄主的動力學參數(shù)，但具體菌根真菌對其寄主的動力學參數(shù)的影響是正面影響還是負面影響有待于進一步對菌根共生體進行研究探討。

4 結(jié)論

供試菌株均能較好地吸收上述3種氮源，其中Pisolithus tinctorius715的優(yōu)勢氮源為Lactarius delicious-1、Lactarius delicious-2和Lactari-us delicious-3的優(yōu)勢氮源為

Lactarius delicious3個株系吸收氮的動力學參數(shù)Cmin(菌根真菌凈吸收大于零時的外界溶液中養(yǎng)分元素的濃度)在0.52～0.82 μmol/L 之間，遠遠小于土壤溶液中氮的濃度，表明供試外生菌根真菌在極其貧瘠的土壤中仍能有效地吸收氮素，有益于樹木對痕量氮的利用。此外，不同外生菌根真菌氮素的吸收位點和氮的親和力不同，吸收氮的能力也不一樣，說明在不同生態(tài)條件下，可能存在不同的高效吸收氮素的優(yōu)良外生菌根真菌。

Lactarius delicious-3吸收和Glu-N的Km和Cmin值最小，能適應低養(yǎng)分的土壤環(huán)境，是供試松乳菇株系中吸收和Glu-N效率最高的菌株，在貧瘠土壤上植樹造林可能有一定的應用前景。

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