王麗芳，陳婷婷，王 琪，韓建榮*

(1.山西大學 生命科學學院，山西太原 030006;2.山西大學 生物技術研究所，山西 太原 030006)

蘆筍(Asparagus officinalisL.)為百合科天門冬屬植物，原產歐洲南部地中海沿岸及小亞細亞，已有2 000多年的栽培歷史。在西方，蘆筍被視為珍貴上等、藥食兼用的蔬菜，有“菜中之王”的譽稱［1］。我國從美國引種蘆筍以來，現種植面積已達6.67萬 hm2以上［2］，主要分布于福建、江蘇、浙江、河南、安徽和山西等?。?］，尤其山西省永濟市，目前已成為年采收面積近2萬hm2的全國最大蘆筍生產基地。蘆筍的可食部分是其嫩莖，嫩莖的采收有嚴格的季節(jié)限制和采收標準。每年在收獲季節(jié)過后，蘆筍的地上莖仍要繼續(xù)生長，高度可長到1.5 m以上，有時甚至達到2 m以上，蘆筍的這部分莖稱之為蘆筍老莖。與嫩莖相比，蘆筍老莖由于木質纖維化程度較高，失去了食用價值，每年的產量要遠大于可食用的蘆筍嫩莖的量。大量的蘆筍老莖收割后沒有加以充分利用，只能任其自然腐敗，或直接焚燒，這樣既造成資源的極大浪費，也帶來了嚴重的環(huán)境污染。因此，如何有效利用蘆筍老莖是蘆筍產地種植農戶和加工企業(yè)急需解決的問題。由于多種農業(yè)廢棄物可以用來栽培食用菌，所以作為食用菌培養(yǎng)料是利用蘆筍老莖的有效途徑之一。針對如何利用蘆筍老莖資源的問題，本實驗室開展了一系列的研究工作，已經證明了蘆筍老莖經堆制發(fā)酵后可以用來栽培姬松茸(Agaricus blazei)［4］。蘑菇堆肥是一個復雜而又獨特的微生態(tài)系統(tǒng)，是一種由群落結構演替非常迅速的多個微生物群體共同作用，有效分解有機物的動態(tài)生化過程［5-6］。國內外關于蘑菇培養(yǎng)料堆制發(fā)酵期間微生物的生物量、群落結構變化的研究已有大量報道［7-8］。由于蘆筍老莖是一種不同于稻草、麥稈等秸稈的原料，所以其堆制發(fā)酵期間的微生物群落及其演替變化規(guī)律也必然不同于其他原料的堆料。要建立和完善針對蘆筍老莖的堆制發(fā)酵工藝，進而得到一種高質量的蘑菇培養(yǎng)料，對于蘆筍老莖堆制發(fā)酵期間微生物多樣性的研究是非常必要的。研究表明，嗜熱微生物(包括細菌、放線菌和真菌)是蘑菇堆肥高溫期的主要優(yōu)勢菌群［9-10］。本研究對蘆筍老莖堆肥中的嗜熱細菌進行了初步的分離鑒定研究，旨在為下一步制備蘆筍老莖堆料發(fā)酵菌劑以及調控堆料過程提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑藥品 試劑盒:Real Times瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質粒小量提取試劑盒，購自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司;Trans EasyTaqDNA polymerase(5 units/μL)、dNTP(10 mmol/L)、DNA相對分子質量標準品、FastDigestEcoRⅠ限制性內切酶(FD0274)、克隆載體pEASY-T3、宿主感受態(tài)細胞Trans 1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell，均購自北京全式金生物技術有限公司;氨芐青霉素、IPTG、X-gal均購自上海生工生物工程有限公司;引物:細菌16S rDNA序列的通用引物(27F-1541R)，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.2 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基［11］:用于細菌分離，使用前加入制霉菌素(30 U/mL培養(yǎng)基)。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 堆肥配方(質量分數，%):蘆筍老莖70，棉籽殼20，豆餅7.5，過磷酸鈣1，石膏粉1，尿素0.5。按照二次發(fā)酵法進行堆料發(fā)酵，前發(fā)酵18 d，共翻堆4次，移入室內進行后發(fā)酵，60℃保持10 h，50℃保持4 d。以蘆筍老莖堆料堆體四周及中心處為采樣點，采樣深度約20 cm左右，四分法采樣。在前發(fā)酵每次翻堆前和后發(fā)酵前后共采樣6次，采樣時間分別為建堆后第4天、第6天、第9天、第11天、第15天和第22天，采集的樣品依次編號為A、B、C、D、E和F，每次取樣量為500 g，按每袋100 g裝入無菌牛皮紙袋，該樣品必須在0～4℃保存，并盡快進行后續(xù)實驗。

1.2.2 菌株分離 準確稱取1 g堆肥樣品于99 mL裝有玻璃珠的無菌水中，充分振蕩后，靜置，采用倍比稀釋法將樣品稀釋至10－3、10－4、10－5、10－6稀釋度。分別吸取10－4、10－5、10－6稀釋度懸液0.2 mL，涂布于牛肉膏蛋白胨平板，每個稀釋度涂3個，45℃培養(yǎng)12 h后觀察，并挑取單菌落。將分離到的菌株分別編號。

1.2.3 菌株鑒定 ①細菌16S rDNA PCR擴增模板的制備:采用菌落PCR方法［9］制備細菌的16S rDNA片段。具體步驟:每株菌取10個單菌落，加1 mL ddH2O煮沸5 min后，12 000 r/min離心2 min，取上清液作為模板進行PCR擴增;②16S rDNA片段的PCR擴增:為了獲得高質量的16S rDNA PCR產物，對模板量和菌落煮沸時間進行了比較。模板量設計如下5個梯度:2.5、5.0、7.5、10.0和12.5 μL。煮沸時間設計如下5個梯度:1、3、5、7和9 min。反應體系(25 μL):10×Trans EasyTaqBuffer，2.5 μL;dNTP，1 μL;引物(20 μmol/L)各2.5 μL;Trans EasyTaqDNA polymerase，0.5 μL;DNA 模板，0.5 μL;ddH2O 補至25 μL。各試劑加好后，輕輕混勻。陰性對照不加模板。反應條件:預變性94℃、5 min;變性94℃、30 s;退火55℃、30 s;延伸72℃、90 s;35個循環(huán)后，72℃保溫10 min。擴增產物和回收產物均經1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，UV凝膠成像系統(tǒng)檢測;③16S rDNA片段PCR產物的連接、轉化、測序:1)連接:向無菌離心管中加入目的片段16S rDNA回收產物4 μL和載體1 μL，混勻后于25℃反應30 min，4℃反應16 h;2)轉化(無菌操作):a.取感受態(tài)細胞(100 μL)，將5 μL 連接產物全部加入其中，溫和混勻，冰浴放置30 min;b.迅速轉入42℃水浴，熱激30 s，再迅速冰浴冷卻2 min后，加入900 μL LB培養(yǎng)基，37℃下90 r/min振蕩培養(yǎng)50 min;c.取上述菌液，12 000 r/min離心2 min，棄去上清液900 μL，剩下的100 μL，加入10 μL IPTG(質量分數 20%)和20 μL X-gal(20 mg/mL)，混勻后，輕輕涂到LB平板(含有氨芐青霉素，其終濃度為50 μg/mL)，涂勻。37℃培養(yǎng)12～16 h后可見藍色或淺黃色菌落;3)重組子的擴大培養(yǎng):a.挑取連接轉化體單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基(含有氨芐青霉素，其終濃度為50 μg/mL)中，37℃下200 r/min過夜培養(yǎng);b.將培養(yǎng)好的菌液分成2管，1管提取質粒DNA作酶切篩選用，另1管留作測序用。EcoRⅠ限制性內切酶酶切篩選:向無菌EP 管中依次加入8 μL ddH2O、0.5 μLEcoR Ⅰ Buffer、1 μL 質粒DNA、0.5 μLEcoRⅠ，于37℃反應2 h。反應結束后，產物經0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測，含有目的片段重組子的大小總共約為4 600 bp;4)重組子測序:選取含目的片段的重組子進行測序。測序由華大基因研究中心完成?？寺【幪柗椒?因為本實驗樣品來自于蘆筍老莖堆料(Asparagus old stem compost)，所以克隆編號方法為“ASC+重組子號”;④菌株16S rDNA序列的同源性分析:將測序獲得的陽性克隆的16S rDNA序列運用CHECK_CHIMERA程序在線進行嵌合體檢驗并去除明顯的Chimera序列。在GenBank數據庫(http://www.ncbi.nlm.gov/)中用VECTOR SCREEN程序剔除載體序列，經BLAST比對后對菌株進行同源性分析。將本實驗獲得的序列與GenBank數據庫中最相似的序列一起使用軟件Clustal X 1.8和MEGA 3.1，采用鄰近法(Neighor Joining)法，在Kimura雙參數模型(Kimura 2-parameter)下，繪制相關菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap檢驗系統(tǒng)樹;⑤16S rDNA序列在GenBank數據庫中的登錄號:本實驗所獲得的16S rDNA序列均已提交GenBank數據庫，登錄號分別為JQ795996～JQ796008。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離

45℃條件下，采用稀釋涂布法和劃線分離法從蘆筍老莖堆肥6個樣品中共分離出菌落形態(tài)有明顯區(qū)別的22株細菌，其中A樣品6株，B樣品6株，C樣品4株，D樣品2株，E樣品2株，F樣品2株。

2.2 菌株16S rDNA的PCR擴增

實驗結果表明:模板生物量對PCR擴增效果影響不大，只要在2.5～12.5 μL 范圍內即可得到理想的PCR產物(圖1);煮沸時間對PCR結果有影響，煮沸時間不能太長，1、3、5 min都可以得到較理想的PCR產物，而7 min和9 min的目的產物較少而非特異性產物較多(圖2)。

圖1 模板量對16S rDNA PCR擴增的影響Fig.1 Effect of amounts of template on PCR-amplified 16S rDNA

圖2 煮沸時間對16S rDNA PCR擴增的影響Fig.2 Effect of boiling times on PCR-amplified 16S rDNA

2.3 菌株16S rDNA序列的測定和比對

分離到的22株嗜熱細菌的16S rDNA測序結果經BLAST比對結果見表1，同源性分析結果如下:A樣品中，6株均屬于芽胞桿菌屬(Bacillus)，分別與地衣芽胞桿菌Bacilluslicheniformis(GU191905)、Bacillus massilliensis(DQ350816)、枯草芽胞桿菌枯草亞種Bacillus subtilissubsp.subtilis(GU191916)、芽胞桿菌Bacillussp.(EU362153)、蠟狀芽胞桿菌Bacilluscereus(FJ189786)、嗜熱淀粉芽胞桿菌Bacillus thermoamylovorans(HM030742)的同源性最高。

表1 樣品中的細菌菌株16S rDNA序列的比對結果Table1 Identification of the bacteria strains isolated from six samples by the 16S rDNA

B樣品中，1株屬于假黃色單胞菌屬(Pseudoxanthomonas)，1株屬于腸桿菌屬(Enterobacter);4株屬于芽胞桿菌屬，分別與地衣芽胞桿菌Bacillus licheniformis(GU191905)、Bacillus massilliensis(DQ350816)、蠟狀芽胞桿菌Bacillus cereus(FJ189786)、嗜熱淀粉芽胞桿菌Bacillus thermoamylovorans(HM030742)的同源性最高。C樣品中，1株屬于芽胞桿菌屬，1株屬于假黃色單胞菌屬(Pseudoxanthomonas)，1株屬于類芽胞桿菌屬(Paenibacillus)，1株與短短芽胞桿菌Brevibacillus brevis(AP008955)的同源性最高。D樣品中，1株與地衣芽胞桿菌Bacillus licheniformis(GU191905)的同源性最高，菌株D-b2在Gen-Bank數據庫中未找到與其相似的已知細菌序列，分類地位待定。E樣品中，1株與嗜熱淀粉芽胞桿菌Bacillus thermoamylovorans(HM030742)的同源性最高，1株與Pseudoxanthomonassp.(HQ912776)的同源性最高。F樣品中，1株與Pseudoxanthomonassp.(HQ912776)的同源性最高，1株與副球菌Paracoccussp.(EF070124)的同源性最高。從鑒定結果可以看出樣品間菌株有重復，根據同源性分析的結果將6個樣品中的12株細菌的16S rDNA序列和同源性最高的已知菌株的序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。從本實驗的結果可以看出，蘆筍老莖堆肥中的嗜熱細菌主要是芽胞桿菌(Bacillusspp.)和假黃色單胞菌(Pseudoxanthomonasspp.)。

3 討論

常規(guī)PCR擴增前需要制備、純化模板DNA，其方法主要有酸酚法、堿酚法、堿性SDS裂解法、煮沸裂解法和氯化銫-溴化乙錠密度梯度離心法等［12］。這些方法各有其優(yōu)缺點:有的操作繁瑣、難度大，有的成本較高。例如，作為一種經典的方法，酚-氯仿抽提法是通過蛋白酶K的消化及有機試劑酚、氯仿的抽提獲得基因組DNA。這種方法獲得的DNA雖然質量較高，但試劑昂貴，操作繁瑣，需要一些特殊處理，因此DNA的產率較低，需要大量的菌種材料。另外，酚、氯仿等試劑不僅對DNA有害，而且其殘留還會抑制PCR反應中Taq酶的活性［13］。菌落PCR方法最早是由Güssow和Clackson［14］提出的。用無菌牙簽挑取單個菌落到TE緩沖液中，煮沸5 min，漩渦振蕩后短暫離心，用1～2 μL裂解液作為DNA模板。該方法省去抽提模板DNA這一步，不失為一種準確、快速、經濟的好方法［15］。

本實驗嘗試采用菌落PCR方法，不提取基因組DNA，而是直接以菌體煮沸后暴露的DNA為模板進行PCR擴增。實驗對模板生物量和煮沸時間分別設計了5個梯度，結果證明該方法可以很好地大規(guī)模地對蘆筍老莖堆料中分離到的多個菌株進行鑒定。不僅提高了實驗效率、降低了實驗成本，還可減少或避免因操作步驟過多產生污染所帶來的假陽性等問題，是一種切實可行的檢測和監(jiān)測方法。

國內外有大量關于蘑菇堆肥中微生物的研究報道［16-19］。在前發(fā)酵階段，料溫升至60℃以上時，細菌大量繁殖，降解掉原料中簡單的易被降解的糖類物質［20］。從本實驗的結果可以看出，蘆筍老莖堆肥中的嗜熱細菌主要是芽胞桿菌(Bacillusspp.)、假黃色單胞菌(Pseudoxanthomonasspp.)，這與文獻報道的其他秸稈堆肥中的優(yōu)勢嗜熱可培養(yǎng)細菌基本相符［16-19］。值得注意的是本實驗分離得到的細菌中有1株在GenBank數據庫中未找到與其相似的已知菌株的序列，分類地位待定，這為下一步從蘆筍老莖堆料中篩選分離有價值的新嗜熱可培細菌提供了可能。

圖3 樣品中12株細菌的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequences of 12 strains from the samples

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