修翠娟，王艷華，孟 雙，陳 杰，吳英春

(1.遼寧省微生物科學研究院，遼寧朝陽 122000;2.遼寧省科技創(chuàng)新體系建設服務中心，遼寧沈陽 110004)

北蟲草是一種名貴藥用真菌，(Cordyceps militaris(L.)Link)又稱蛹蟲草，北冬蟲夏草，是一種兼具食用和藥用價值的大型真菌。隸屬子囊菌門、肉座菌目、麥角菌科、蟲草屬，是蟲草屬的模式種，為蟲生藥用真菌。近年的研究表明，北蟲草除了富含蛋白質、氨基酸、維生素及鈣、錳、鋅、硒等微量元素外，還含有蟲草素、蟲草酸、過氧化物歧化酶(SOD)等生物活性物質，具有增強動物機體免疫力、抗腫瘤、抗輻射、降血糖、降血脂、抗疲勞、延緩衰老等多種生理功效［1-2］。因滋補、藥用功效與天然冬蟲夏草相近，選為冬蟲夏草的最佳替代品而進行大量的人工培育，近些年來栽培范圍呈逐漸擴大趨勢［3］。北蟲草菌絲變異很快，種性退化要比一般的菌類快的多，優(yōu)良菌種的選育是提高北蟲草子實體生物轉化率和產品質量的前提條件和關鍵。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 北蟲草鮮體的收集 前后共收集到北蟲草鮮體8個品株，具體生長特征見表1、圖1。

1.1.2 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基配方:馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，磷酸氫二鉀0.1 g，硫酸鎂0.1 g，瓊脂20 g，水1 000 mL。

1.2 方法

北蟲草的菌株分離包括組織分離和孢子分離2種。由于孢子分離菌株得到的較多，后期菌株進行比較的工作量較大，并且一些文獻表明，孢子分離得到的北蟲草菌株性狀不穩(wěn)定，而且生物轉化率較組織分離低，子座組織分離得到的北蟲草菌株，一般菌絲發(fā)育健壯、活力強，生物轉化率也較高［4］，本實驗采用組織分離法。

表1 不同品種的北蟲草生長特征對比Table1 Characteristics of Different Cordyceps militaris

圖1 不同品種的北蟲草生長特征對比Fig.1 Characteristics of Different Cordyceps militaris

1.2.1 菌種組織分離 ①消毒:取新鮮、顏色鮮艷、生長正常、形態(tài)健壯、顏色橙黃或橘紅色北蟲草子座，先用清水沖洗，再置于75%的酒精或0.1%升汞中浸泡消毒2～3 min，取出子座以無菌水反復沖洗子座2～3次，放在無菌器皿內備用;②組織分離培養(yǎng):用無菌剪刀將消毒的蛹蟲草子座剪成長度1～2 mm的小段，接種于PDA試管或平板固體培養(yǎng)基上，放置在22～25℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48～72 h，菌絲開始萌發(fā)，在組織塊周圍長出放射狀的菌絲。北蟲草菌絲白色，粗壯濃密，呈匍匐狀緊貼培養(yǎng)基生長。及時選擇無污染的菌絲體，接種于新的培養(yǎng)基上進一步分離，最終得到純化的北蟲草菌株。第一代菌株為母種，為F0級，依次傳代為F1級，F2級，F3級。

1.2.2 出草實驗 為驗證分離菌種是否為所需菌種，把分離得到的菌種回接到米飯或小麥培養(yǎng)基上進行出草試驗，接種后生長速度快，不污染，生長周期短，從子座形成到成熟不超過50～60 d，出草整齊，草型好，生物轉化率高的菌種可作為優(yōu)良的生產菌種。在蛹蟲草的栽培過程中，不出草的原因大多是因為菌種質量有問題。所以優(yōu)質的菌種是出草的前提，精細的管理是高產優(yōu)質的保證。

2 結果與分析

菌株的鑒定:組織分離得到的北蟲草菌株需要進行菌株鑒定，以確定得到的菌株是否是北蟲草菌株。菌株鑒定包括直接觀察法、鏡檢法、出草實驗。

2.1 北蟲草菌體在PDA固體培養(yǎng)基上的生長情況觀察

直觀法就是靠人的肉眼進行直接觀察菌落形態(tài)，蛹蟲草菌絲體初期為白色，粗壯，呈絨毛狀，略有爬壁。受光線刺激與基質結合處呈現黃色。隨著時間的延長，由黃色逐漸變成橘黃色。觀察不同的蛹蟲草菌體在PDA培養(yǎng)基上的生長情況，結果見表2、圖2。

表2 不同北蟲草菌絲體在PDA培養(yǎng)基5 d生長情況Table2 Growth of different cordyceps militaris on PDA Culture after 5 day

圖2 不同北蟲草菌絲體在PDA培養(yǎng)基5 d生長情況Fig.2 Growth of different cordyceps militaris on PDA Culture after 5 day

一般來說，蛹蟲草菌絲體在第2～3天可觀察到，第4、5天左右生長較好，菌落生長旺盛。優(yōu)質的蛹蟲草菌株在培養(yǎng)初期菌絲為白色，粗壯濃密，邊緣整齊，匍匐狀緊貼培養(yǎng)基生長，培養(yǎng)后期或者見光后，分泌黃色色素，菌落呈淺黃色到橘黃色。蛹蟲草菌絲變異很快，種性退化要比一般的菌類快的多，如果只是單純的分離留菌種，就有可能大面積的減產。所以對北蟲草菌種生長特性的觀察與研究非常重要。

2.2 出草實驗

除了對北蟲草的菌落及顯微形態(tài)觀察外，還應該進行出草實驗，出草實驗是最直接的鑒定方法，對于分離得到的菌株，在用于生產之前都必須做出草實驗，以了解其出草情況、質量、生長周期和生物學效率。在出草實驗期間，主要觀察各個菌株萌發(fā)的時間、見光轉色的能力以及是否形成大量的氣生菌絲，以及出草時間是否正常，出草是否整齊等。有的蛹蟲草菌株在營養(yǎng)生長階段受到微弱的光刺激就可以轉色，并進入原基分化階段;而有的蛹蟲草菌株即使長滿培養(yǎng)基并給予充分的光刺激也不發(fā)生轉色效應，這樣的菌株一般難以出草，必須及時淘汰。有的雖然出草，但很慢使得生產周期延長，或者雖然出草但長短不一，較稀疏，或者菌株變異草體異常變粗或變細，這樣的菌株都不能做為生產菌株。

3 討論

高產菌株的篩選直接關系到北蟲草人工栽培的商業(yè)回報，優(yōu)良的北蟲草子實體是獲得優(yōu)良人工栽培菌株的首要保證［6］。用于組織分離的蟲草子座必須新鮮、生長正常、形態(tài)健壯、顏色橙黃或橘紅色。子座分離的不同部位對子實體生長的影響都非常大。

在進行規(guī)模生產前，必須從獲得的北蟲草菌株中選取性狀優(yōu)良的進行出草實驗，出草實驗成功后才可進行真正的規(guī)模生產。

北蟲草高產菌株的篩選有許多關鍵因素，篩選出優(yōu)良菌株后，菌株的保藏條件、保藏時間，傳代復壯次數都對北蟲草的生長有至關重要的影響［7］。優(yōu)良的菌株傳2～3代后活力性狀下降，不能保證正常出草，必須再挑選優(yōu)良的北蟲草子座再次進行組織分離，重新篩選優(yōu)良高產栽培菌株，優(yōu)良菌株的收集與篩選是北蟲草生產的重要基礎。

［1］李亞潔，王鶴，孟楠，等.蛹蟲草菌種復壯技術的研究［J］.食用菌，2006，28(2):18-19.

［2］鄭劍玲，齊賀，黃竹青，等.北蟲草菌絲發(fā)酵液和子實體抗氧化活性測定［J］.微生物學雜志，2012，32(6):93-95.

［3］都興范，李亞杰，王林華，等.北冬蟲夏草的研究發(fā)展現狀［J］.遼寧農業(yè)科學，2003，(4):26-28.

［4］江西強，張韌.北冬蟲夏草的形態(tài)特征及人工瓶栽技術［J］.江蘇農業(yè)科學報，2002，6:84-85.

［5］康信聰，劉東波，夏志蘭，等.北冬蟲夏草DNA提取方法的比較［J］.湖南農業(yè)大學學報(自然科學版)，2011，37(2):147-149.

［6］孫葉，陳秀蘭，嚴巧玲，等.蛹蟲草規(guī)?；斯ぴ耘嗉夹g要點［J］.江蘇農業(yè)科學，2008，(6):145-146.

［7］姜明蘭，鐘文田.北冬蟲夏草人工栽培技術研究［J］.遼寧農業(yè)科學，1995，(1):54.