李治瀅，楊麗源，李紹蘭，董明華，周新麗，肖 煒，董亞仲，楊有清，楊云溢

(1.云南大學省微生物研究所，云南昆明 650091;2.南鹽化股份有限公司喬后鹽礦，云南大理 651207;3.云南鹽化股份有限公司一平浪鹽礦，云南楚雄 651214;4.云南鹽化股份有限公司昆明鹽礦，云南昆明 650300)

鹽礦環(huán)境屬于極端環(huán)境，生存在極端環(huán)境中的微生物，具有極為特殊的生理結構和代謝機制，同時還產生了許多具有特殊性質的生物活性物質。所以對鹽礦真菌的活性研究既具有理論意義，又有應用價值。目前對云南鹽礦微生物的研究主要集中在對放線菌、細菌和古菌的資源及新種研究［1-4］，對真菌的研究只局限在本課題組對一平浪鹽礦的耐鹽真菌種群調查。本研究對云南喬后鹽礦、一平浪鹽礦和昆明鹽礦的真菌進行抗菌活性和產胞外酶活性的篩選及活性真菌菌株的鑒定，為今后開發(fā)云南鹽礦真菌的應用奠定理論基礎及菌種資源的儲備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 實驗樣品于2009年11月采自云南省喬后鹽礦、一平浪鹽礦和昆明鹽礦。樣品有鹽鹵、鹽鹵水源、巖鹽礦、鹽鹵池底泥及鹽鹵池周圍土壤。

1.1.2 供試指示菌 環(huán)境病原細菌:枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis);人體致病細菌:大腸埃希菌(Escherichia coli)，藤黃八疊球菌(Sarcina lutea)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，表皮葡萄球菌(Staphylococcus aureus);人體致病真菌:白假絲酵母(Candida albicans)，石膏樣小孢子菌(Microsporum gypseum)，星形石膏樣毛癬菌(Trichophyton gypseum asteroides);植物病原真菌:木霉(Trichodermasp.)，小克銀漢霉(Cunninghamellasp.)，毛殼菌(Chaetomiumsp.)，灰葡萄孢(Botrytis cinerea)，根串珠霉(Thieliviopsissp.)。以上供試菌株均為云南省微生物研究所保存。

1.1.3 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基(g/L):①鹽礦真菌分離培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂15)，臨用時加青霉素(80 U/mL);馬丁氏培養(yǎng)基(葡萄糖10，蛋白胨5，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5，孟加拉紅0.033，瓊脂1.8)，倒皿時加青霉素(80 U/mL);YM培養(yǎng)基(酵母膏3，蛋白胨5，麥芽汁3，葡萄糖10，瓊脂20)，臨用時加1 mol/L的鹽酸溶液(0.7 mL/100 mL)。以上培養(yǎng)基中分別按5%、10%、15%、20%(質量體積比)加入氯化鈉;②抗菌活性篩選培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基，PDB培養(yǎng)基，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(蛋白胨5，牛肉膏3，氯化鈉5，瓊脂15，pH 7.0)和沙博弱氏(Sabouraud)瓊脂培養(yǎng)基(葡萄糖4，蛋白胨10，瓊脂18，pH 5.6);③胞外酶活性篩選培養(yǎng)基:蛋白酶培養(yǎng)基［5］，淀粉酶培養(yǎng)基［6］，纖維素酶培養(yǎng)基［7］，脂肪酶培養(yǎng)基［8］;④鑒定培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基，誘發(fā)真菌孢子的培養(yǎng)基(KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5，KNO31，KCl 0.5，蔗糖0.2，葡萄糖0.2，瓊脂20)。在1×105Pa滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 鹽礦真菌的分離 巖鹽礦、底泥及土壤樣品采用梯度稀釋涂皿法，鹽鹵及水源樣品采用過濾收集菌體或原樣品直接涂皿法進行真菌分離。置于室溫避光培養(yǎng)5～45 d。

1.2.2 鹽礦真菌發(fā)酵液的制備 ①將分離所得的真菌菌株分別接入PDB培養(yǎng)基中，于(28±2)℃，160 r/min的搖床上振蕩培養(yǎng)6 d，過濾去除菌體，發(fā)酵液作為產胞外酶活性篩選備用;②同樣制備發(fā)酵液，在發(fā)酵液中加等體積的95%乙醇浸提48 h以上，過濾棄菌絲體濃縮浸提液，制成菌株的發(fā)酵浸提樣品以備用作抗菌活性篩選。

1.2.3 指示菌的培養(yǎng) 將指示菌接入營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基、沙博弱(Sabouraud)氏斜面或PDA培養(yǎng)基斜面，置于(37±1)℃或(28±1)℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)待用。

1.2.4 鹽礦真菌抗菌活性的初篩和復篩 選取14株指示菌進行抗菌活性篩選，對鹽礦真菌的發(fā)酵乙醇浸提濃縮液進行抗菌實驗?？咕鷮嶒灢捎脼V紙片法進行，方法參照文獻［9］。

1.2.5 產胞外酶活性真菌的篩選 選取產蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶及脂肪酶4種培養(yǎng)基，采用紙片平板篩選方法對所分離獲得的真菌進行產胞外酶活性的定性篩選:在無菌條件下用濾紙片蘸取鹽礦真菌發(fā)酵液，分別輕輕平放在相應的孢外酶定性篩選培養(yǎng)基上，置于(28±1)℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4 d，觀察其透明圈及暈圈。

1.2.6 活性菌株的鑒定 采用插片培養(yǎng)方法，對篩選到的活性菌株通過顯微形態(tài)特征的觀察進行鑒定，鑒定檢索參照文獻［10-11］。

1.2.7 活性菌株的耐鹽(NaCl)實驗 挑選具有表現(xiàn)較好功能酶活性或抗菌活性的真菌菌株34株進行耐鹽(NaCl)實驗?；A培養(yǎng)基為PDB，采用振蕩培養(yǎng)((28±2)℃，160 r/min)，每3 d觀察其生長情況，直到15 d。NaCl濃度(質量體積比)分別為:0%、3%、5%、8%、10%、12%、15%、18%、20%、25%、30%和35%共12個濃度。

2 結果與分析

2.1 3個鹽礦真菌的分離結果

通過在分離平板上菌落的挑取、純化和并菌，從云南3個鹽礦中共獲得真菌523株。喬后鹽礦279株，昆明鹽礦138株，一平浪鹽礦106株。

2.2 抗菌活性篩選結果

2.2.1 活性菌株的初步鑒定 經過抗菌活性的初篩和復篩，獲得51株有抗菌活性的菌株，初步鑒定為3個目、1個類群、4個科、19個屬(見表1)。

表1 云南3個鹽礦抗菌活性菌株數量及分布Table1 The distribution and number of antifungal strains of fungi isolated from three salt mines in Yunnan

2.2.2 活性菌株的分布 51株有抗菌活性的菌株占分離總菌株數的9.75%;喬后鹽礦、昆明鹽礦和一平浪鹽礦各有29株、13株和9株(見表1)。在抗菌活性菌株中，青霉(Penicillium)和曲霉(Aspergillus)是3個鹽礦共有的屬，其中青霉有23株為優(yōu)勢屬，占活性菌株的45.10%;曲霉(Aspergillus)有7株，占活性菌株數的13.73%;喬后鹽礦的活性菌株種群分布最豐富，有14屬，側孢(Choloridium)、漢斯霉(Hansfordia)、殼小圓孢(Coniothyrium)、綠僵菌(Metarrhizium)、毛莖點霉(Chaetophoma)、稀絲頭孢霉(Haplotrichum)、芽枝霉(Cladosporium)、粘帚霉(Gliocladium)、束絲菌(Ozonium)、絲核菌(Rhizoctonia)、組絲核菌(Phacodium)、絲葚霉(Papulospora)只在喬后鹽礦有分布;昆明鹽礦的活性菌株有5個屬，阜孢霉(Papularia)、交鏈孢(Alternaria)和盤單毛孢霉(Monochaetia)僅在昆明鹽礦有分布;一平浪鹽礦的活性菌株有4個屬，木霉(Trichoderma)和盤多毛孢霉(Pestalo-tia)只出現(xiàn)在一平浪鹽礦。

2.2.3 活性菌株的抗菌活性 在篩選得到的抗菌活性菌株中，對白假絲酵母(Candida albicans)有抗菌活性的菌株最多，共有26株，占抗菌活性菌株數的50.98%，并且分布的菌株種群多，涉及16個屬;其次是拮抗木霉和灰葡萄孢(Botrytis cinerea)菌株，分別有23株和20株;對大腸埃希菌(Escherichia coli)和根串珠霉(Thieliviopsis)有抗菌活性的菌株較少，分別僅為5株和3株;未篩選到對銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)有抗菌活性的菌株(見表2)。本次研究共有10株鹽礦真菌對本次實驗中的5株及5株以上的指示菌有拮抗作用。

2.3 產胞外酶活性定性篩選結果

2.3.1 產酶菌株的初步鑒定 采用紙片平板篩選法對所分離獲得的3個鹽礦真菌進行產胞外酶活性的定性初篩和復篩，結果有67株具有產胞外酶的活性，初步鑒定為3個目、1個類群、5個科、26個屬(見表3)。

表2 云南3個鹽礦真菌抗菌活性及其分布Table2 Antipathoginic activities strains and distribution of fungi isolated from three salt mines in Yunnan

續(xù)表

表3 云南3個鹽礦產胞外酶真菌菌株及分布Table3 Production of extracellular enzymes strains and distribution of fungi isolated from three salt mines in Yunnan

2.3.2 產酶菌株的分布 67株產胞外酶活性菌株占總菌株數的12.81%;喬后鹽礦、一平浪鹽礦和昆明鹽礦各篩選到35株、21株和11株(見表3)。在3個鹽礦的產胞外酶活性菌株中，青霉屬均是它們的優(yōu)勢屬種，分別占喬后鹽礦、一平浪鹽礦和昆明鹽礦活性菌株中的34.29%、42.86%和63.64%;在產酶活性菌株的種群分布中，喬后鹽礦分布的較廣，有17個屬，其次是一平浪鹽礦11個屬，昆明鹽礦只分布有5個屬;在活性菌株的分布中，青霉屬和曲霉屬在3個鹽礦中均有分布，芽枝霉屬、束絲菌屬和絲核菌屬只分布在喬后鹽礦和一平浪鹽礦。

2.3.3 產酶菌株的產酶活性 在4種胞外酶的定性篩選結果中，產胞外纖維素酶的有58株，產蛋白酶和淀粉酶的菌株各有41株和26株(見表4)，各占3個鹽礦產酶活性菌株86.57%、61.19%和38.81%;產纖維素酶的菌株種群最多，有25個屬，產蛋白酶和淀粉酶的各有13個屬和11個屬;獲得9株能同時產胞外纖維素酶、蛋白酶和淀粉酶的鹽礦真菌:青霉和曲霉各3株，殼小圓孢、盤多毛孢霉和交鏈孢各1株。本次研究未篩選到產胞外脂肪酶的菌株。

表4 云南3個鹽礦真菌的產胞外酶篩選結果Table4 The results of production of extracellular enzymes of fungi isolated from three salt mines in Yunnan

續(xù)表

2.4 活性菌株的耐鹽實驗結果

從3個鹽礦的抗菌活性或產酶活性的篩選結果中挑選了34株活性較好的真菌菌株進行耐鹽(NaCl)實驗。結果都有不同程度的耐NaCl特性(見表5)，其中有7株的耐鹽濃度達到35%，最低的為10%。34株真菌菌株其耐鹽濃度的差異較大。耐NaCl濃度為35%的主要為青霉屬，還有曲霉屬和交鏈孢屬。

表5 云南3個鹽礦真菌活性菌株的耐鹽實驗結果Table5 The results of salt-tolarant experiment of fungi isolated from three salt mines in Yunnan

3 討論

從云南3個鹽礦篩選到的抗菌活性菌株，對白假絲酵母有拮抗作用的最多，其中有3株為高抗菌株(抑菌圈直徑≥15 mm)，分別為青霉、曲霉和阜孢霉?？咕钚跃曛杏?株具有廣譜抗菌作用，能對本次實驗中的8株指示菌有不同程度的拮抗作用，分別為綠僵菌屬和曲霉屬。

具有抗菌和產胞外酶活性能力的鹽礦真菌有16株:青霉8株，曲霉2株，稀絲頭孢霉、側孢、毛莖點霉、盤多毛孢霉、芽枝霉和殼小圓孢各1株。在這16株菌株中有2株的耐鹽濃度均可達35%，產蛋白酶和纖維素酶的活性較強;有2株為30%，它們分別屬于青霉和曲霉。高鹽環(huán)境能夠激活真菌的一些沉默基因，產生低鹽環(huán)境所不產生的代謝產物。所以本實驗中篩選到高鹽環(huán)境中具有抗菌活性和產胞外酶能力的真菌菌株，為今后尋找新型的抗生素藥物開辟新資源，同時也為工業(yè)治污、排污提供新的微生物資源。

致謝感謝云南鹽化股份有限公司在工作上的鼎力相助，在此表示誠摯謝意!

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