向廷生，郭曉博，張祥勝

(1.長江大學油氣資源與勘探技術教育部重點實驗室，湖北荊州 434023;2.長江大學地球環(huán)境與水資源學院，湖北荊州 434023;3.鹽城師范學院生命科學與技術學院，江蘇鹽城 224002)

大量的研究表明，生物表面活性劑可以通過膠束來滲透、潤濕、乳化、消泡等作用促進石油的利用，有效提高石油烴的降解，加快油污土壤的修復過程。生物表面活性劑分子結構一般包括親水性離子基團和長鏈疏水基團2個部分，表面活性劑分子的2個部分的基團通常是不對稱的，親水基可以是酯、羥基、磷酸鹽、羧酸鹽基團或者是糖基，憎水基可以是蛋白質(zhì)，或者是含有憎水性支鏈的縮氨酸等，此種結構上的兩親特點，決定了表面活性劑的許多物理化學性質(zhì)，不同結構的生物表面活性劑有不同的表面活性，因此為了發(fā)揮生物表面活性劑的功能，就必須對其物理化學性質(zhì)進行系統(tǒng)的研究［1-3］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 出發(fā)菌 烴降解菌8-11，本實驗室由大慶油田污染土壤中分離并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①無機鹽培養(yǎng)基:MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO41.0 g，KH2PO41.0 g，NH4NO31.0 g，F(xiàn)eSO40.05 g，CaCl20.02 g，水 1 000 mL，pH 7.0～7.2;②油平板培養(yǎng)基:無機鹽培養(yǎng)基+18 g瓊脂+2 g原油;③烴降解搖瓶培養(yǎng)基:無機鹽培養(yǎng)基+2 g原油;④葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基:無機鹽培養(yǎng)基+13 g葡萄糖;⑤實驗用油:大慶油田南6-40-丙619井。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理及離子注入 ①樣品制備:菌株活化培養(yǎng)24 h后，菌液用生理鹽水稀釋至相應倍數(shù)后，取0.1 mL涂布于90 mm平皿上，置超凈工作臺吹干，并設真空對照;②N+離子注入處理:離子注入在中國科學院等離子體物理研究所離子束生物工程學重點實驗室采用離子束生物工程裝置進行。注入?yún)?shù):20 keV N+，脈沖式注入，間隔10 s，每個脈沖30個單位，每個單位注入劑量為2.6×1013個離子/cm2，注入速度約為每秒2個單位，靶室真空度約為10－2Pa，束流400 μA。注入劑量分別為0、30、60、90、120、150個單位，每個劑量均設真空對照(即注入劑量為0)，并做3個平行樣;③N+離子注入菌株存活率及突變率測定:存活率是通過注入前后活菌計數(shù)來測定的，注入結束時，用1 mL生理鹽水將平皿中的菌體洗下，稀釋后涂于肉胨培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48 h后計算存活率，存活率=各處理劑量的總單菌落數(shù)/真空對照的總單菌落數(shù)。各劑量處理菌的發(fā)酵液表面張力值分別與真空對照組比較，統(tǒng)計出正突變率(表面張力值比出發(fā)菌株降低≥5.0%)和負突變率(表面張力值比出發(fā)菌株提高≤5.0%);④發(fā)酵液表面張力測定:采用上海衡平儀器儀表廠生產(chǎn)的BZY-1表面張力儀測定發(fā)酵液表面張力;⑤生物表面活性劑排油活性測定:取一培養(yǎng)皿，加50 mL去離子水，水面上加0.1 mL石蠟形成油膜，在油膜中心滴入10 μL搖瓶發(fā)酵液，中心油膜被擠向四周形成一圓圈，圓圈直徑與表面活性劑活性成正比［4-5］，測量圓圈直徑大小;⑥產(chǎn)物特性分析:取出培養(yǎng)168 h的發(fā)酵液，8 000 r/min離心30 min，去除發(fā)酵液里的菌體和雜質(zhì)。上清液用6 mol/L HCl調(diào)pH至2.0，出現(xiàn)絮狀沉淀，4℃靜置12 h;10 000 r/min、4℃離心30 min收集沉淀;用少量的pH 2.0的HCl洗滌沉淀，1 mol/L NaOH將沉淀調(diào)至pH 7.0，然后用CH2Cl2萃取，振蕩20 min后靜置12 h，取出下層溶液即產(chǎn)物。旋轉蒸發(fā)儀減壓蒸干即得表面活性劑粗品［4］。二氯甲烷抽提后烘干稱重，用傅立葉變換紅外光譜儀分析產(chǎn)物成分;⑦石油烴降解率測定:發(fā)酵液過濾除去菌體和培養(yǎng)基，將二氯甲烷洗脫的殘油液用活化的顆粒狀無水硫酸鈉脫水，過濾后用旋轉蒸發(fā)儀蒸干，轉置預先恒重的小瓶中。氮氣吹脫至恒重，采用重量法測定培養(yǎng)液中殘油含量，與對照培養(yǎng)液比較計算烴降解率。石油降解率的計算公式:

其中，m1為初始培養(yǎng)基中石油質(zhì)量，mi為培養(yǎng)id后剩余的石油質(zhì)量［7］。烴降解菌8-11，篩選出的誘變菌23，系本實驗室由大慶油田污染土壤中分離并保存。

1.2.2 樣品處理及離子注入 ①樣品制備:菌株活化培養(yǎng)24 h后，菌液用生理鹽水稀釋至相應倍數(shù)后，取0.1 mL涂布于90 mm平皿上，置超凈工作臺吹干，并設真空對照;②N+離子注入處理:離子注入在中國科學院等離子體物理研究所離子束生物工程學重點實驗室采用離子束生物工程裝置進行。注入?yún)?shù):20 keV N+，脈沖式注入，間隔10 s，每個脈沖60個單位，每個單位注入劑量為2.6×1013個離子/cm2，注入速度約為每秒2個單位，靶室真空度約為10－2Pa，束流400 μA。注入劑量分別為0、30、90、150個單位，每個劑量均設真空對照(即注入劑量為0)，并做3個平行樣;③N+離子注入后的突變菌篩選:經(jīng)過油平板的篩選，篩選出3株能產(chǎn)生較大噬油斑的突變株。根據(jù)排油能力和表面張力的測定，最終篩選出1株產(chǎn)表面活性劑能力強且能較好降解原油的誘變菌23。經(jīng)過測定，誘變菌23發(fā)酵液的表面張力值從空白對照的56.1 mN/m降低為29.3 mN/m，比出發(fā)菌降低了3.4 mN/m，排油圈直徑為7.3 cm，表明發(fā)酵液中有較多的生物表面活性劑產(chǎn)生。

2 結果與分析

2.1 菌株產(chǎn)表面活性劑與菌體生長的關系

本實驗采用分光光度計測定不同培養(yǎng)時間細菌的菌量，在恒定的培養(yǎng)條件下，繪制菌株的生長曲線，由此來反映菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長情況。由圖1可見，初始階段發(fā)酵液的表面張力隨菌體量的增加而降低，一段時間內(nèi)菌量緩慢增加，表面張力也慢慢開始降低，在45 h時細菌生長達到最高峰，發(fā)酵液的表面張力也降到最低;繼續(xù)發(fā)酵，菌數(shù)和表面活性劑的量都有所降低，可見，菌株產(chǎn)表面活性劑的方式為生長相關型。

圖1 菌濃度和表面張力隨時間的變化Fig.1 The changes of the strain concentration and the surface tension in optimized culture medium

2.2 生物表面活性劑的提取、純化與定性

生物表面活性劑的提取、純化見1.2.1⑥。

2.2.1 離子型分析 采用亞甲基藍-氯仿試驗鑒別離子型表面活性劑。取上清液，加入三氯甲烷和亞甲基藍溶液，劇烈振蕩后，充分混勻，靜置并觀察。如果氯仿層呈藍色證明有陰離子存在，則該菌產(chǎn)生的生物表面活性劑為陰離子型［4-5，7］。在亞甲基藍-氯仿實驗，氯仿層明顯變藍，所以判斷該菌所產(chǎn)出的表面活性劑為陰離子型，見圖2。

2.2.2 定性分析 薄層色譜(TLC)分離:取發(fā)酵液離心，上清用等體積氯仿/甲醇(2/1，體積比)混合，靜置，離心，取上清進行薄層層析，以氯仿/甲醇/水為展開劑，待展開劑最前沿移至硅膠板上緣時，取出，干燥后對產(chǎn)生的表面活性劑進行分析結果表明，本實驗所篩選得到的菌株所產(chǎn)生物表面活性物質(zhì)主要成分為糖脂類物質(zhì)［8-10］。圖3紅外光譜的分析表明，3 200/cm處是由分子鏈間氫鍵引起的N—H鍵的伸縮振動;2 860、1 375/cm處吸收帶為脂肪族肽鏈中C—H鍵的強振動;1 700～1 730/cm是內(nèi)酯羰基C=O的伸縮振動;1 000～1 100/cm為芳基烷基中—C—O—C—的伸縮振動;說明分子中有一個五元環(huán)狀內(nèi)酯和糖苷鍵存在。上述結果表明，本實驗所篩選得到的菌株所產(chǎn)生物表面活性物質(zhì)主要成分為糖脂類物質(zhì)。

圖2 亞甲基藍-氯仿實驗Fig.2 Ethylene blue-Chloroform experiment

圖3 生物表面活性物質(zhì)紅外光譜圖Fig.3 The IR chart of biosurfactants

2.3 生物表面活性劑的臨界膠束濃度測定

表面活性劑是一種兩性分子，既含有親水基，又含有憎水基，通常2個基團是不對稱的［11］，結構上的兩親性決定了其能定向的吸附于兩相界面，聚集形成單分子層以表面活性劑濃度為橫坐標，溶液表面張力為縱坐標作圖，曲線的轉折點所對應的濃度即為臨界膠束濃度。

圖4 表面張力法測定菌株產(chǎn)生的表面活性劑的臨界膠束Fig.4 Determination by surface tension for CMC of strain 23

實驗結果(如圖4)表明，由菌株產(chǎn)生的生物表面活性物質(zhì)在很低的濃度時就可以達到臨界膠束濃度，從而使表面張力降到最低，這說明表面活性物質(zhì)是非常有效的，也說明表面活性劑的應用潛力是很大的。

2.4 不同因素對生物表面活性劑表面活性的影響

2.4.1 溫度的影響 為了測定溫度對糖脂類生物表面活性劑表面活性的影響，取純化得到的表面活性劑樣品溶于pH 7.0的蒸餾水，制備濃度大于CMC的50 mg/L的糖脂溶液，分別加熱至30、40、50、60、70、80、90、100℃并保持2.5 h，待冷卻至室溫后測定溶液的表面張力值經(jīng)實驗結果如圖5糖脂類表面活性劑對溫度并不敏感，有很好的穩(wěn)定性，表現(xiàn)出較強的高溫耐受性。

圖5 溫度對表面活性劑表面活性的影響Fig.5 The effect of temperature on surface tension of biosurfactant

為了進一步考察糖脂對熱的穩(wěn)定性，結果如圖6可以看到該糖脂表面活性劑對熱較穩(wěn)定，100℃水浴10 h后仍保留原活性的60%，但14 h后幾乎完全失去活性，該糖脂類表面活性劑的這一特點對其在高溫條件下的使用是較好的。

圖6 糖脂表面活性劑的熱穩(wěn)定性Fig.6 The influence of temperature to surface tension of biosurfactant solution

2.4.2 pH值的影響 取純化得到的表面活性劑樣品溶于pH 7.0的蒸餾水，制備濃度大于CMC的50 mg/L的糖脂溶液，分別用NaOH和HCl將pH值調(diào)為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，放置24 h后，測定不同pH值下的糖脂水溶液的表面張力值，考察其對酸堿的耐受度。由圖7看出，在pH 2.0～5.0范圍內(nèi)，該糖脂表面活性劑溶液的表面張力值基本不受影響，在pH 5.0之后隨著pH的升高，其表面張力逐漸升高;當pH大于8.0后表面張力明顯增高，表面活性下降，由此可以看出，該糖脂類表面活性劑在堿性條件下不穩(wěn)定，但在酸性條件下較穩(wěn)定。

2.4.3 鹽度的影響 取純化得到的表面活性劑樣品溶于pH 7.0的蒸餾水，制備濃度大于CMC的50 mg/L的糖脂溶液，加入一定量的NaCl攪拌均勻，使其濃度為0、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、20%、30%，放置24 h，待其充分溶解后在30℃下測不同NaCl濃度的糖脂溶液的表面張力值，考察其對鹽的耐受度。實驗結果表明，該糖脂類生物表面活性劑對鹽有極高的耐受性，濃度高達14%的鹽對糖脂表面活性劑溶液表面張力沒有明顯影響，這種良好的抗鹽性為其在不同條件下進行環(huán)境生物修復的應用創(chuàng)造了較好的基礎，見圖8。

圖7 pH對表面活性劑表面活性的影響Fig.7 The effect of pH on surface tension of biosurfactant

圖8 NaCl濃度對表面活性劑表面活性的影響Fig.8 The effect of NaCl concentration on surface tension of biosurfactant

2.5 生物表面活性劑對烴的乳化性能分析

許多微生物在以烴為碳源的培養(yǎng)基中生長可誘導細胞產(chǎn)生生物表面活性劑，這些生物表面活性劑有助于培養(yǎng)基中烴基質(zhì)的乳化，并能刺激微生物對烴的攝取，促進菌體細胞生長，繼而提高烷烴的降解率［12-13］。將發(fā)酵液與石蠟各5 mL混合，充分振蕩3 min后，油水形成均勻的白色乳化液，將乳化液倒入量筒中于室溫條件下靜止放置，待出現(xiàn)清晰的水油界面時開始觀察乳化層的體積，每隔12 h測定兩相體積數(shù)，室溫下連續(xù)觀察20 d，并計算乳化指數(shù)，繪出生物表面活性劑對石蠟的乳化指數(shù)隨時間變化的關系圖，見圖9。實驗結果說明該糖脂類生物表面活性劑具有很好的乳化活性，在微生物采油、環(huán)境生物修復和食品工業(yè)等領域?qū)⒂袕V闊的應用前景。

圖9 生物表面活性劑的乳化性能Fig.9 The biosurfactants the emulsifying properties

2.6 生物表面活性劑對原油降解率的影響

2.6.1 添加量的影響 將生物表面活性劑配制成100 mg/L的溶液，設置不加生物表面活性劑的原油培養(yǎng)基為空白，分別取2、4、6、8和10 mL加入原油培養(yǎng)基中，原油培養(yǎng)基中烴降解菌的接種量為2 mL，25℃，180 r/min培養(yǎng)7 d后測定原油的降解率，見圖10。

圖10 生物表面活性劑的添加量對原油降解率的影響Fig.10 The affection of adding amount of biosurfacants on oil degradation

從圖10看出，添加生物表面活性劑后原油的降解率顯著增加，但當生物表面活性劑加到一定量時，原油的降解率并沒有顯著增加。

2.6.2 添加時間的影響 取2 mL 100 mg/L的生物表面活性劑溶液加入原油培養(yǎng)基中，添加時間分別為加菌前8、4 h，和菌同時加入，加菌后4、8 h，25℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d后測定原油的降解率。從圖11可以看出，先加生物表面活性劑再加烴降解菌有利于更大程度的提高原油的降解率。

圖11 生物表面活性劑的添加時間對原油降解率的影響Fig.11 The affection of adding time of biosurfacants on oil degradation

3 討論

菌株產(chǎn)生物表面活性劑的方式為生長相關型，菌株發(fā)酵液初提后得到棕黃色粉末狀物質(zhì)，經(jīng)薄層層析和紅外光譜分析，初步判斷為糖脂類生物表面活性劑，亞甲基藍-氯仿實驗顯示該離子型為陰離子型，菌株所產(chǎn)生物表面活性劑的CMC為40 mg/L，對其乳化特性進行研究發(fā)現(xiàn)，在起始的48 h內(nèi)，乳化體積呈下降趨勢，但下降速度很慢，72 h后，發(fā)酵液的乳化體積仍能達到75%，并能持續(xù)較長時間，說明該生物表面活性劑對石蠟乳化性能穩(wěn)定，増溶效果良好。對高溫，高鹽和酸有較強的耐受力，在溫度20～100℃，鹽濃度0%～14%，pH 2～14顯示出較好的表面活性。

隨著生物表面活性劑添加量的增加，原油的降解率增加，但當生物表面活性劑添加到一定量時，原油的降解率趨于平緩，在使用中考慮到生物表面活性劑的制備提純較復雜，成本較高，因此其最佳添加量為60 mL/L，原油降解率可顯著提高。先添加生物表面活性劑將原油乳化后有利于烴降解菌對原油的攝取，從而提高原油的降解率。

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