陳 光，曹雅明，劉 蕾，蔡連順，畢 勝，蘇菊香，代 月

(1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室，黑龍江佳木斯 154007;2.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，遼寧沈陽 110001;3.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，黑龍江佳木斯 154007)

瘧疾是瘧原蟲通過媒介昆蟲蚊傳播的人類最為嚴(yán)重的寄生原蟲感染性疾病。每年全世界約有655萬人感染瘧疾，其中將近100萬人死亡，絕大多數(shù)為5歲以下的兒童［1-2］。新的研究證實(shí)，不同種屬瘧原蟲混合感染在發(fā)展中國家是一種普遍現(xiàn)象。尤其在瘧疾流行區(qū)，惡性瘧原蟲同時(shí)伴隨間日瘧原蟲或三日瘧原蟲混合感染約占瘧疾總感染人數(shù)的30%以上［3-5］。瘧疾的流行已成為全球性最嚴(yán)重的三大公共衛(wèi)生問題之一，給全球尤其是發(fā)展中國家?guī)砹藝?yán)重的健康危害和沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［6］。到目前為止，無有效疫苗能有效地預(yù)防瘧疾感染［7］。因此，研制安全、價(jià)廉和有效的瘧疾疫苗是人類控制乃至根除瘧疾的重要途徑，也是當(dāng)今世界迫切需要解決的重點(diǎn)課題。而瘧原蟲感染宿主機(jī)體應(yīng)答的免疫學(xué)、分子生物學(xué)等綜合基礎(chǔ)研究是其重要前提。瘧疾與其他大多數(shù)感染性疾病一樣，需要通過免疫效應(yīng)機(jī)制對其控制和消除。同時(shí)，由于過強(qiáng)的炎癥反應(yīng)引起腦瘧等免疫病理損傷也是這一疾病的突出特征。IL-10是一種抗炎性細(xì)胞因子，由巨噬細(xì)胞(M?)、樹突狀細(xì)胞(DC)、B細(xì)胞以及CD4+和CD8+T細(xì)胞亞類分泌。IL-10通過抑制M?和DCs的功能，限制了Th1/Th2型免疫應(yīng)答的發(fā)生;DC或M?分泌的IL-10能誘導(dǎo)自然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(nTreg)產(chǎn)生IL-10，從而阻止了宿主病理損傷的出現(xiàn)，但卻允許病原體長期逃避免疫系統(tǒng)控制并引起長期(通常無癥狀)感染［8］。目前，IL-10在瘧疾感染尤其是混合感染中作用的研究尚未深入展開。有限的研究結(jié)果顯示，一種瘧原蟲單獨(dú)感染時(shí)IL-10是由自然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(nTreg)、Th1/Tr1、DC和M?分泌的，其主要作用地位體現(xiàn)在抑制Th1應(yīng)答，減少IL-12和IFN-γ的分泌;通過抗體中和或基因敲除，發(fā)現(xiàn)IL-10-/-小鼠TNF-α、IFN-γ水平增高，瘧原蟲清除能力增強(qiáng)，死亡率升高，發(fā)生免疫病理損傷/腦瘧的機(jī)率明顯增加［8-10］。因此，本實(shí)驗(yàn)擬利用P.y17XL、P.cAS單獨(dú)感染和P.y17XL+P.cAS混合感染鼠瘧模型，明確IL-10在瘧疾混合感染過程中的作用地位，這一研究無疑將為瘧疾等感染性疾病的有效控制提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、瘧原蟲 6～8周齡、雌性DBA/2小鼠由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供(許可證編號:SCXK京200420001);P.y17XL和P.cAS(日本愛媛大學(xué)分子寄生蟲學(xué)教研室惠贈(zèng))。

1.1.2 主要試劑 SYBR GREEN quantitative kit(Quigen，Germany);IL-10R Ab(clone 1B1.3a;Biolegend company)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染及分組 DBA/2小鼠分為正常對照組、P.y17XL單獨(dú)感染組、P.y17XL和P.cAS瘧原蟲混合感染組和P.cAS單獨(dú)感染組，9只/組，分別經(jīng)腹腔感染1×106P.y17XL、P.cAS和P.y17XL+P.cAS(1∶1)寄生的紅細(xì)胞，感染不同時(shí)間的小鼠經(jīng)尾靜脈采血，制備薄血膜，Giemsa染色，光學(xué)顯微鏡鏡檢瘧原蟲，計(jì)數(shù)紅細(xì)胞感染率。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測蟲負(fù)荷 于感染第后3、5、8、10、12和19天分別尾靜脈取血100 μL，肝素抗凝后短暫離心，采用高純度DNA提取試劑盒抽提DNA;根據(jù)2種瘧原蟲的MSP-1基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物:P.y17XL MSP-1 F5'-ACCATCAACATCTACACCAGCAC-3'，R5'-CAGGCATATCCTCTTCACTTTCT-3'，擴(kuò)增長度為 110 bp;P.cAS MSP-1 F5'-GTAACATC ACAACCAGCATCAAC-3'，R5'-CGACAAACATTTCGTCTTCACTT-3'，擴(kuò) 增 長度為100 bp。

1.2.3 脾細(xì)胞培養(yǎng) 分別于感染后第0、1、3、5、8、10、12和 15天，無菌取出小鼠脾臟，用RPMI1640培養(yǎng)液制備濃度為1×107個(gè)/mL脾細(xì)胞懸液，于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)48 h，收集培養(yǎng)上清，-80℃保存。

1.2.4 細(xì)胞因子的檢測 用雙抗體夾心ELISA試劑盒檢測脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-10水平，按試劑盒說明操作，酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度(A)值。以試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品測定結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，應(yīng)用SoftMax Pro 4.3.1LS軟件分析，計(jì)算細(xì)胞因子含量(pg/mL)，結(jié)果以±s表示。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件，雙尾t檢驗(yàn)分析比較各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 瘧疾混合感染小鼠原蟲血癥水平及生存率

P.cAS感染小鼠原蟲血癥水平迅速持續(xù)升高，感染后第9、10天達(dá)峰值約33.17±10.89%，感染小鼠全部死亡;而P.y17XL感染小鼠全部存活，感染后3 d和9 d原蟲血癥水平僅為1.66±0.4%和24.9±7.1%，隨后迅速下降;相比P.y17XL+P.cAS混合感染小鼠的原蟲血癥水平也于感染后9 d達(dá)峰值約34±5.5%，小鼠生存率為100%(見圖1A、1B)。

圖1 瘧原蟲感染小鼠不同時(shí)間原蟲血癥水平(A)及生存率(B)Fig.1 Parasitemia(A)and survival rate(B)of P.y17XL，P.y17XL+P.c AS and P.c AS infection in DBA/2 mice in different time after infection

2.2 瘧疾混合感染小鼠蟲負(fù)荷水平檢測

同等數(shù)量的P.y17XL和P.cAS瘧原蟲混合后腹腔注射DBA/2小鼠，RTQ-PCR檢測感染小鼠體內(nèi)2種瘧原蟲蟲負(fù)荷水平。小鼠混合感染后3～12 d，P.y17XL 占優(yōu)勢;而感染后 15～19 d，P.cAS占優(yōu)勢(見圖2)。

圖2 瘧疾混合感染小鼠不同時(shí)間瘧原蟲蟲負(fù)荷水平Fig.2 Quantitative PCR analysis of DBA/2 miceco-infected with P.y17XL and P.cAS.Proportions of each strain measured in mixed-infections mice during the different time point after infection

圖3 混合感染小鼠感染后不同時(shí)間脾細(xì)胞上清中細(xì)胞因子IL-10水平檢測Fig.3 Level of IL-10 in spleen cell supernatants during different infections in different time point

2.3 瘧疾混合感染小鼠IL-10水平變化

混合感染小鼠IL-10水平于感染后第1～3天無明顯變化，感染后第8天達(dá)峰值，隨后迅速下降，于感染后第10天下降至正常水平;P.y17XL感染小鼠IL-10水平于感染后第1d既出現(xiàn)有意義的升高，第5天達(dá)峰值(P＜0.01)，此后雖有回落但仍維持其高水平;相比，P.cAS感染小鼠IL-10水平在感染后第3d出現(xiàn)迅速的有意義的升高(P＜0.01)，第8天達(dá)峰值，是同天混合感染小鼠IL-10水平的2倍(圖3)。

3 討論

瘧疾與其他大多數(shù)感染性疾病一樣，需要通過免疫效應(yīng)機(jī)制對其控制和消除。同時(shí)，由于過強(qiáng)的炎癥反應(yīng)引起腦瘧等免疫病理損傷也是這一疾病的突出特征。不斷積累的研究數(shù)據(jù)表明:紅內(nèi)期階段宿主通過強(qiáng)烈的促炎性免疫反應(yīng)控制瘧原蟲增殖并促進(jìn)感染紅細(xì)胞清除，同時(shí)也嚴(yán)格調(diào)控免疫介導(dǎo)病理損傷(嚴(yán)重合并癥)的程度［9，11］，在瘧疾感染過程中IL-10對促炎性應(yīng)答具有重要的調(diào)節(jié)作用［12］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):P.y17XL單獨(dú)感染和混合感染小鼠IL-10水平在感染后第5和8天分別達(dá)峰值，隨后開始下降至正常水平，小鼠蟲血癥均達(dá)中等水平，存活率100%;相比P.cAS感染小鼠IL-10在感染后第3天突然出現(xiàn)高水平升高并且維持時(shí)間較長;于感染后第8天達(dá)峰值，是同天P.y17XL單獨(dú)感染和混合感染小鼠IL-10水平的2倍，蟲血癥水平較高，小鼠全部死亡。由此提示，決定瘧疾混合感染病理損傷嚴(yán)重性的應(yīng)答效應(yīng)明顯受控于宿主免疫網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)，而IL-10可能正是在瘧疾混合感染的發(fā)生和發(fā)展過程中處于舉足輕重的作用地位。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子IL-10具有雙向免疫調(diào)節(jié)活性，即負(fù)向調(diào)節(jié)作用及其免疫刺激作用。IL-10發(fā)揮不同的免疫學(xué)功效主要與IL-10蛋白的濃度、不同的微環(huán)境和病理?xiàng)l件及其不同的微環(huán)境、不同細(xì)胞和病理?xiàng)l件中IL-10受體表達(dá)格局的不同導(dǎo)致了IL-10不同的免疫學(xué)活性［13］。

同時(shí)發(fā)現(xiàn)，混合感染小鼠于感染后18 d自愈。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，混合感染小鼠，于感染后3～12 dP.y17XL增殖占優(yōu)勢，而感染后15～19 d則P.cAS增殖處于優(yōu)勢狀態(tài)。相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究證明:與其它瘧原蟲蟲株相比，P.cAS生長相對緩慢，針對生長速度不同的瘧原蟲，宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答強(qiáng)度具有明顯差異性［14］;嚙齒類動(dòng)物混合感染模型證明:感染早期，P.y17XL能抑制P.cAS的生長［15］;同時(shí)人們發(fā)現(xiàn)針對一種寄生蟲感染造成的特有的致命性病理損傷能被同時(shí)感染的另一種寄生蟲減輕，不同瘧原蟲蟲株之間存在著拮抗作用［16］。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)以IL-10為核心的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)與瘧疾感染過程中病理損傷密切相關(guān)。同時(shí)提示混合感染小鼠應(yīng)答模式與P.y17XL感染小鼠的應(yīng)答模式相同。上述問題的闡明不僅將進(jìn)一步明晰瘧疾免疫應(yīng)答相關(guān)機(jī)制的本質(zhì)，而且研制誘導(dǎo)物種間交叉免疫為靶向的瘧疾疫苗新策略提供積極的指導(dǎo)意義，同時(shí)也為瘧疾的免疫治療手段開拓新的思路。

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