陳詠君，田素飛，褚云卓*，郭麗潔，丁麗萍，李富順

(1.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，遼寧沈陽 110001;2.沈陽醫(yī)學院附屬沈洲醫(yī)院檢驗科，遼寧沈陽 110001)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)是醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染的常見病原菌之一，可以引起皮膚和全身的廣泛感染［1-2］。社區(qū)獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(community-acquired methicillin-resistantStaphylococcus aureusCA-MRSA)感染主要侵犯皮膚軟組織，感染類型包括癤、膿腫、毛囊炎、蜂窩織炎等，嚴重時可引起膿毒癥，甚至導致壞死性肺炎。CA-MRSA可以產(chǎn)生多種毒素，主要有α型苯酚可溶解的調控蛋白(phenolsoluble modulins，PSMα)、葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal enterotoxins，SEs)、葡萄球菌溶血素、殺白細胞素(Panton-Valentine leukocidin，PVL)、表皮剝脫性毒素(exfoliative toxins，ETs)以及中毒性休克綜合征毒素-l(toxic shock syndrome toxin 1，TSST-1)等［3］。我國CA-MRSA中ST59型為常見的基因型［4-5］，但其相關的毒力因子尚無系統(tǒng)報道，本文檢測了ST59型CA-MRSA的PSMα、PVL、SEA、SEB、SEC、SED、SEE、TSST-1、ETA、ETB基因，以了解ST59的毒力因子，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 5株金黃色葡萄球菌菌株(P14，2997，E14，6048，6131)均來自2007～2008年中國醫(yī)科大學附屬一院門診及住院患者的臨床分離的非重復菌株，其中6048和6131分離自同一患者的不同標本，其余來自不同患者的皮膚軟組織及血培養(yǎng)標本。5株菌的mecA基因均為陽性，SCCmecⅣ型［6-7］。5株金黃色葡萄球菌菌株經(jīng)MLST分析，均為ST59型CA-MRSA。

1.1.2 主要試劑與儀器 細菌基因組提取試劑盒(博日生物技術有限公司);Tag酶及PCR相關試劑(寶泰克大連生物科技有限公司);PCR引物(上海生工有限公司合成);菌種鑒定卡(法國生物梅里埃公司產(chǎn)品)、VITEK-2全自動微生物分析儀(法國生物梅里埃公司產(chǎn)品)、PCR9700(Gene Amp)、電泳儀(美國Bio-Rad公司產(chǎn)品)、HZQF160振蕩培養(yǎng)箱(上海);超速低溫離心機(貝克曼);紫外凝膠成像儀(美國Alpha Innotech)。

1.1.3 引物設計與合成 根據(jù)GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)公布的基因序列，利用Primer Premier 5.0 軟件及參考文獻設計［8］，引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

表1 PSMα、SEs、ETs、TSST-1、PVL 基因引物一覽表Table1 PSM2、SEs、ETs、TSST－1、PVL gene Primers list

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用細菌基因組提取試劑盒，嚴格按照操作說明提取基因組DNA。

1.2.2 PCR擴增體系 擴增反應總體積為25 μL，6×Buffer緩沖液5 μL，Taq酶(5 u/H1)0.25 μL，dNTP 3 μL，引物各4 μL，模板5 μL，加無菌去離子水至25 μL。

1.2.3 PCR反應條件 擴增SEs基因熱循環(huán)參數(shù)為:95℃預變性4 min，95℃1 min，55℃ 1 min，72℃ 2 min，循環(huán)30次，72℃延伸7 min;擴增ETA、ETB和TSST基因循環(huán)參數(shù)為:95℃預變性4 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，循環(huán)30次，72℃1 min，72℃延伸1 min;擴增PVL基因熱循環(huán)參數(shù)為:94℃預變性5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，循環(huán)30次，72℃延伸5 min。擴增PSMα基因熱循環(huán)參數(shù)為:94℃預變性5 min，94℃ 1 min，53℃ 1 min，72℃ 1 min，循環(huán)35次，72℃延伸10 min。

1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳 1 g瓊脂糖粉末與100 mL 0.5×TBE緩沖液混合加熱煮沸，冷卻至80℃后，制備成1%的瓊脂糖凝膠。2 μL上樣緩沖液與5 μL PCR擴增產(chǎn)物混合后加入1%瓊脂糖凝膠孔，10×TBE為電泳緩沖液，用水平式電泳槽140 V，電流為80 mA，時間為40 min。EB染色20 min，300 nm紫外燈觀察結果，凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.2.5 DNA測序 對PCR擴增陽性的PSMα和PVL基因片段委托上海生物工程有限公司進行序列測定，與GenBank序列數(shù)據(jù)庫標準序列進行比對分析。

2 結果與分析

2.1 毒力因子檢出情況

5株ST59型CA-MRSA全部檢出PSMα基因(見圖1)和檢出PVL基因(見圖2);5株ST59型CA-MRSA均未檢出SEA、SEB、SEC、SED、SEE、TSST-1、ETA、ETB基因。

圖1 α型苯酚可溶解的調控蛋白(phenol-soluble modulins，PSMα)Fig.1 Phenol-soluble modulins，PSMα

圖2 殺白細胞素(Panton-Valentine leukocidin，PVL)Fig.2 Panton-Valentine leukocidin，PVL

2.2 測序結果

PCR擴增陽性的5株PSMα和5株PVL基因片段測序結果見圖3、圖4，與GenBank序列數(shù)據(jù)庫標準序列進行比對完全一致。

圖3 PSMα基因測序結果Fig.3 The results of PSMα gene Sequencing

圖4 PVL基因測序結果Fig.4 The results of PVL gene Sequencing

3 討論

社區(qū)獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(CA-MRSA)已經(jīng)在世界各地廣泛流行，不同于醫(yī)院相關性MRSA(HA-MRSA)的顯著特性是可產(chǎn)生多種毒素，如α型苯酚可溶解的調控蛋白、腸毒素、溶血素、表皮剝脫性毒素、殺白細胞素等，多侵襲既往健康的社區(qū)人群，且頻繁發(fā)生壞死性肺炎及筋膜炎，給人類的健康造成極大的威脅。

目前國內(nèi)尚未見過對ST59型CA-MRSA攜帶PSMα基因進行系統(tǒng)檢測的報道。在本研究中的5株CA-MRSA，mecA基因均為陽性，SCCmec均為Ⅳ型，經(jīng)MLST分析均為ST59型。5株ST59型CA-MRSA經(jīng)PCR擴增后均攜帶PSMα基因和PVL基因［6-7］。近來的研究對于PVL基因在CAMRSA菌株流行和致病中所起到的作用存在分歧，但在本研究中5株ST59型CA-MRSA均檢出PVL基因，因此認為PSMα基因和PVL基因是ST59型CA-MRSA的常見毒力因子。事實上，PSMα基因強烈的影響對于CA-MRSA的感染在小鼠的菌血癥和膿腫模式已經(jīng)顯示的十分清楚［9］。在CA-MRSA的感染中PSMα基因具有很強的促炎和增強毒力的作用［8］。PSMα基因在ST59型CA-MRSA的感染中是否具有較強的促炎和增強毒力的作用將在今后的研究中繼續(xù)證明。

本研究中的5株ST59型CA-MRSA均未檢測出攜帶腸毒素SEA-SEE基因、TSST-1基因、ETA和ETB 基因，這與蔡朝陽等［10－11］報道陽性率為9.68%差異較大，考慮可能為不同標本，不同地域，不同自然環(huán)境，金黃色葡萄球菌流行菌株也不同，其攜帶毒素基因亦不一樣。本研究中分離的標本均為患者的皮膚軟組織及血培養(yǎng)標本，并無水皰或廣泛皮膚脫落患者，考慮感染類型不同，ST59型CA-MRSA攜帶毒素基因也不同。

總之，ST59型CA-MRSA的毒力和致病機制非常復雜，在克隆傳播和疾病的發(fā)病中可能涉及多種因素。人們一直在努力找到一種或幾種能夠確定的毒力因子來闡明ST59型CA-MRSA毒力增強的原因。對ST59型CA-MRSA毒力因子的認識可以促進抗ST59型CA-MRSA治療的發(fā)展。因此有必要進一步研究上述毒力因子在ST59型CA-MRSA致病中的作用。

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