劉 哲，詹良靜，張新宜，王欣榮

(中國醫(yī)藥集團總公司四川抗菌素工業(yè)研究所，四川成都 610052)

谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸經(jīng)肽鍵縮合而成的一種同時具有γ-谷氨?；蛶€基生物活性的三肽化合物，具有氧化型和還原型兩種形態(tài)，可應用于醫(yī)藥及食品領域的是其還原態(tài)［1］。還原型谷胱甘肽具有重要的生理功能，例如抗氧化功能、對外來物質(zhì)的解毒功能和提高免疫力的功能，臨床上多作為保肝類藥物使用［2］。谷胱甘肽的生產(chǎn)方法主要有化學合成法、生物法和提取法3種［3］。由于化學合成法得到的GSH消旋體(左旋體和右旋體的混合物)需要進行光學拆分，分離十分困難且容易造成環(huán)境污染，因此化學合成法獲得的GSH產(chǎn)品純度不高。提取法主要是通過萃取和沉淀的方法從含有GSH的動植物組織中分離提取，但是由于GSH在組織中含量極低、原料不易獲得、制取的GSH純度和收率不高等原因，導致該法的實際應用價值不大［3］。生物法包括微生物發(fā)酵法和酶法，目前國外工業(yè)化生產(chǎn)GSH的主要方法是微生物發(fā)酵法，所應用的菌種是釀酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母等能夠大量積累GSH的菌株［4-5］。發(fā)酵法生產(chǎn)GSH的關鍵問題在于如何在提高細胞密度的同時加大細胞內(nèi)GSH含量，二者有機結合將有利于生產(chǎn)效率的提高［6］。菌種選育是一種切實可行的提高胞內(nèi)GSH含量的方法，普通野生型酵母細胞內(nèi)GSH的含量并不高，只有采用物理的或化學的方法使出發(fā)菌株發(fā)生變異，才能使GSH在胞內(nèi)大量積累，進而實現(xiàn)GSH的高產(chǎn)［7］。在選育到優(yōu)良菌株的同時，還需要在發(fā)酵過程中設法提高細胞密度，以提高GSH的總產(chǎn)量。補料分批發(fā)酵是獲得酵母高細胞密度培養(yǎng)的最有效方法。在發(fā)酵過程中補入3種前體氨基酸將有利于提高胞內(nèi)GSH含量，進而提高GSH產(chǎn)量［8-9］。本實驗以釀酒酵母作為出發(fā)菌株，通過紫外誘變結合乙硫氨酸和氯化鋅的底物選擇篩選高產(chǎn)GSH釀酒酵母菌株，并利用10 L發(fā)酵罐研究了釀酒酵母高密度發(fā)酵工藝和前體氨基酸補加工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 出發(fā)菌株:釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SC-001，由本研究組保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①平板及斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，酵母提取物10，蛋白胨20，瓊脂20，pH自然;②種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，酵母提取物10，蛋白胨20，pH自然;③發(fā)酵培養(yǎng)(g/L):甘蔗糖蜜120，(NH4)2HPO49，復合氨基酸5，甘氨酸2，半胱氨酸5，KH2PO40.4，MgSO4·7H2O 0.3，ZnCl20.5，pH自然;④乙硫氨酸氯化鋅選擇平板培養(yǎng)基:普通平板培養(yǎng)基+乙硫氨酸+氯化鋅。

1.1.3 試劑與儀器 乙硫氨酸購自Sigma公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。2010-LC型高效液相色譜儀(島津)、10 L微生物發(fā)酵罐(上海高機生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 從活化的菌種斜面上挑取1環(huán)菌體接種至種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度30℃，搖床轉速280 r/min，培養(yǎng)至對數(shù)生長期進行紫外誘變。

1.2.2 誘變方法 取10 mL培養(yǎng)至對數(shù)期的釀酒酵母菌株，4 000 r/min離心10 min收集菌體，用無菌生理鹽水洗2次，加入無菌生理鹽水制成菌懸液，梯度稀釋至菌體濃度在107cfu/mL左右，取5 mL菌懸液放置在直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，在30 W紫外燈下距離30 cm照射一定時間，梯度稀釋并取0.1 mL涂布于平板培養(yǎng)基上(整個過程在紅外燈下操作)。30℃培養(yǎng)48 h后通過活菌數(shù)計算致死率。

1.2.3 篩選方法 紫外誘變的菌懸液經(jīng)梯度稀釋后取0.1 mL涂布到含有乙硫氨酸和氯化鋅的抗性篩選平板上，避光條件下30℃培養(yǎng)48 h，挑取生長快、菌落大的菌株至斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)48 h后接種至發(fā)酵培養(yǎng)進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，經(jīng)72 h發(fā)酵后測定谷胱甘肽含量。

1.2.4 10L發(fā)酵罐發(fā)酵方法 將培養(yǎng)24 h的種子以10%接種量接入發(fā)酵罐，發(fā)酵罐裝液量為6 L，培養(yǎng)溫度30℃，攪拌速度300 r/min，通氣量為6 L/min。①一次性補料發(fā)酵:當發(fā)酵進行到18 h時一次性補入800 mL 50%的葡萄糖;②補料分批發(fā)酵:當發(fā)酵進行到18 h時自動控制發(fā)酵液的pH值為5.5，根據(jù)發(fā)酵液pH的變化流加500 g/L的葡萄糖和10%的氨水，當pH降低時加入氨水使pH升高，當pH超過5.5時則補入葡萄糖;③補料分批發(fā)酵結合前體氨基酸的補加:在補料分批發(fā)酵的基礎上，當菌絲量達到較高程度時一次性補入適量的半胱氨酸、甘氨酸和谷氨酸。實時監(jiān)控發(fā)酵過程中的pH并通過取樣檢測發(fā)酵過程中的生物量、還原糖濃度、細胞內(nèi)GSH含量與GSH產(chǎn)量。

1.2.5 分析方法 ①胞內(nèi)GSH的提取發(fā)酵液經(jīng)4 000 r/min離心10 min后棄上清，加入10 mL去離子水，震蕩混勻后100℃水浴15 min，離心(12 000 r/min)4 min后取上清液用于HPLC分析;②HPLC條件:色譜柱 C18柱(4.6 mm×150 mm)，流動相57 mmol/L磷酸二氫鉀溶液(含庚烷磺酸鈉0.2%，用磷酸調(diào)節(jié)pH為3)-甲醇(30∶1)，流速0.5 mL/min，檢測波210 nm，柱溫35℃，進樣量10 μL;③細胞干重的測定:發(fā)酵液經(jīng)4 000 r/min離心10 min后棄上清，用蒸餾水洗滌2遍，洗滌后的細胞在90℃烘干至恒重后稱重。

2 結果與分析

2.1 紫外線誘變

2.1.1 紫外線誘變致死率及不同濃度乙硫氨酸和氯化鋅對菌株的致死率 按1.2.2方法對菌體進行紫外線誘變處理，統(tǒng)計不同照射時間下菌體的致死率，同時取未經(jīng)照射的出發(fā)菌株為對照組。結果見圖1。

圖1 紫外線誘變的致死率曲線Fig.1 The mortality rate curve of UV radiation

如圖1所示，紫外線的照射時間與菌株的致死率存在明顯的劑量效應關系，隨著照射時間的延長，致死率逐漸提高。但如果照射時間太長，一些高活性菌株也可能致死，故一般選用致死率70%～80%左右的劑量。由圖1可以看出紫外照射時間為30 s時致死率達到78%，因此選擇30 s為適宜的紫外照射時間。乙硫氨酸是GSH的結構類似物，由于菌體內(nèi)GSH可反饋抑制谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性，故可使用乙硫氨酸作為底物篩選反饋抑制突變株;Zn2+是酵母細胞內(nèi)多種酶的輔酶或輔基，低濃度時可促進酵母的生長，高濃度時可抑制多種酶的活性，從而引起酵母細胞的死亡［7，10］。不同濃度的乙硫氨酸和氯化鋅對菌株的致死率如表1所示。

表1 不同濃度的乙硫氨酸和氯化鋅對菌株的致死率Table1 The mortality rate of different concentrations of ethionine and zinc chloride to the strain

如表1所示，當乙硫氨酸濃度為0.9 mg/mL時，菌株致死率為75%;當ZnCl2濃度為0.5 mg/mL時，菌株致死率為72%。進一步實驗確認當0.9 mg/mL乙硫氨酸與0.5 mg/mL的ZnCl2聯(lián)合使用時菌株的致死率為86.5%，致死率太高不利于高產(chǎn)GSH酵母菌株的篩選，故使用0.7 mg/mL的乙硫氨酸與0.4 mg/mL的ZnCl2，進一步實驗確認此濃度下菌株的致死率為73%，適用于下一步篩選。

2.1.2 紫外誘變結果 按1.2.3方法對誘變得到的酵母菌株進行篩選，出發(fā)菌株作為對照。初篩得到145株酵母，經(jīng)發(fā)酵有63個菌株的GSH產(chǎn)量高于出發(fā)菌株，正變率達43.4%。選取GSH產(chǎn)量提高12%以上的11株酵母進行復篩，復篩結果見表2。

表2 紫外誘變高產(chǎn)GSH突變株復篩Table2 The rescreening of the mutant strain with higher GSH production

由表2可知，菌株SC-001-24的GSH產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高22%，胞內(nèi)GSH含量比出發(fā)菌株提高了19%。將SC-001-24連續(xù)傳代6次，每次進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，觀察其遺傳穩(wěn)定性，在幾次傳代中，突變株SC-001-24的谷胱甘肽產(chǎn)量都比出發(fā)菌株提高18%以上，顯示了良好的遺傳穩(wěn)定性，故使用突變株SC-001-24作為后續(xù)研究的出發(fā)菌株。

2.2 10 L發(fā)酵罐發(fā)酵結果

2.2.1 一次性補料發(fā)酵 GSH是胞內(nèi)產(chǎn)物，其產(chǎn)量可以通過兩個途徑提高，一是采用高密度細胞培養(yǎng)技術提高其生物量;二是提高胞內(nèi)GSH含量［6］。按1.2.4的方法進行一次性補料發(fā)酵，圖2是一次性補料發(fā)酵的參數(shù)曲線，由圖2可見發(fā)酵第18 h補加葡萄糖后發(fā)酵液中還原糖濃度由27 g/L上升至84 g/L，如此高濃度的還原糖能保證整個發(fā)酵過程中菌體對糖的需要。一次性補料發(fā)酵在一定程度上類似于對搖瓶發(fā)酵的模擬，這種發(fā)酵方式并不能充分發(fā)揮發(fā)酵罐精確控制的優(yōu)勢，也很難達到細胞高密度培養(yǎng)的目的。由圖2可知在發(fā)酵進行到18 h后發(fā)酵液的pH一直低于4，這種過酸性的環(huán)境不利于細胞的生長;細胞最大生物量出現(xiàn)在第48 h，為34.5 g/L;GSH最高產(chǎn)量在54 h，為402.4 mg/L;細胞內(nèi)GSH含量最高達到1.21%。從發(fā)酵結果來看，GSH產(chǎn)量與細胞生物量均過低，遠不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。

圖2 一次性補料發(fā)酵曲線Fig.2 The course of batch culture

2.2.2 補料分批發(fā)酵 發(fā)酵罐在通氣量控制、補料控制、pH控制等方面具有搖瓶試驗無法比擬的優(yōu)勢，通過將發(fā)酵液pH控制在5.5的恒PH發(fā)酵具有緩和底物抑制、富集高濃度細胞、克服Crabtree效應以及延長操作時間等優(yōu)點［6，11］。按1.2.4的方法進行補料分批發(fā)酵，根據(jù)發(fā)酵液pH的變化流加500 g/L的葡萄糖和10%的氨水，使發(fā)酵液中始終保持較低的葡萄糖濃度，至60 h流加結束，72 h培養(yǎng)結束。由圖3可知，pH自動控制在5.5之后，大部分時間還原糖的濃度低于10 g/L，遠遠低于一次性補料發(fā)酵時的還原糖最低水平，這種低還原糖控制策略減少了乙醇的生成，而發(fā)酵過程中乙醇的產(chǎn)生是不利于GSH在細胞內(nèi)的積累［11］。細胞生物量最高達到47.5 g/L，GSH產(chǎn)量最高達到1 080.8 mg/L，胞內(nèi)GSH含量最高達到2.29%分別比一次性補料發(fā)酵提高了37.7%、168.6%與89.3%。整個發(fā)酵過程共補入560 g葡萄糖，GSH的最高產(chǎn)量出現(xiàn)在66 h，此時胞內(nèi)GSH含量最高，而細胞生物量略低于最高峰。

圖3 補料分批發(fā)酵曲線Fig.3 The course of fed-batch culture

2.2.3 補料分批發(fā)酵結合前體氨基酸補加 據(jù)文獻報道在發(fā)酵過程中補加3種前體氨基酸有利于GSH的積累，但Cys的加入能抑制釀酒酵母細胞的生長，最終降低細胞生物量［9，12］。根據(jù)前期的搖瓶發(fā)酵試驗(搖瓶裝液量25 mL/250 mL)確認在發(fā)酵結束前24 h細胞生物量達到較高程度時一次性補入半胱氨酸1.03 mmol、甘氨酸0.67 mmol和谷氨酸0.34 mmol，有利于GSH的積累，同時對細胞生物量影響較小，因此根據(jù)搖瓶試驗結果選擇在發(fā)酵中后期補加3種前體氨基酸，3種前體氨基酸的補加濃度參考搖瓶試驗結果，分別為半胱氨酸41 mmol/L、甘氨酸26.7 mmol/L、谷氨酸13.7 mmol/L。不同的3種前體氨基酸補加時間對GSH發(fā)酵的影響如表3所示，發(fā)酵進行到40 h和44 h補加3種前體氨基酸對GSH的產(chǎn)量提高最有利，此時細胞生物量在37.58 mg/L與39.01 mg/L之間，因此選擇當發(fā)酵進行至40 h到44 h之間補加3種前體氨基酸。進一步對3種前體氨基酸補加時間進行了驗證，結果見圖4。

表3 3種前體氨基酸補加時間對GSH發(fā)酵的影響Table3 The influence of different addition time of the three precursor amino acids to GSH production

圖4 補料分批發(fā)酵結合前體氨基酸補加Fig.4 The course of fed-batch culture combined with precursor amino acids addition

所示，當發(fā)酵42 h細胞生物量達到37.69 g/L時補入半胱氨酸246 mmol、甘氨酸160 mmol、谷氨酸82 mmol，6 h內(nèi)GSH產(chǎn)量由350.5 mg/L提高至958.7 mg/L。GSH的最高產(chǎn)量出現(xiàn)在60 h，為1 280.4 mg/L，比未補加前體氨基酸時提高了18.5%。細胞最大生物量為43.96 g/L，比未補加前體氨基酸時略低，但胞內(nèi)GSH含量最高為2.91%，比未補加前體氨基酸時提高了 27%。GSH的最高產(chǎn)量出現(xiàn)在發(fā)酵60 h，而未補加前體氨基酸時GSH最高產(chǎn)量出現(xiàn)在發(fā)酵66 h，可見前體氨基酸的補加不僅能夠提高發(fā)酵液中GSH的產(chǎn)量，而且能夠縮短發(fā)酵時間。

3 討論

利用紫外誘變結合乙硫氨酸和氯化鋅的底物篩選可有效篩選出有較高GSH產(chǎn)量的釀酒酵母菌株，經(jīng)過2輪誘變篩選到突變株SC-001-24，其GSH產(chǎn)量為743 mg/L，比出發(fā)菌株提高了22%。通過在10 L發(fā)酵罐中對突變株SC-001-24的發(fā)酵調(diào)控發(fā)現(xiàn)把發(fā)酵液pH控制在5.5的恒PH補料分批發(fā)酵能夠有效提高GSH的產(chǎn)量，GSH產(chǎn)量達到1 080.8 mg/L。結合前體氨基酸的補加，釀酒酵母菌株SC-001-24發(fā)酵生產(chǎn)GSH的最高產(chǎn)量可達1 280.4 mg/L，顯示了良好的應用前景。

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