陸文俊 張曉麗 葉志斌 夏世金

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是一種常見(jiàn)的臨床危急重癥，普通住院患者發(fā)病率為2% ～7%，重癥監(jiān)護(hù)室中的發(fā)病率則高達(dá)10% ～30%。雖然臨床上針對(duì)AKI 采取了一系列的防治措施，但該病的病死率仍高達(dá)30% ～80%。腎缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)是AKI 的最常見(jiàn)病因，至今缺乏有效防治手段［1］。低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia induced factor 1α，HIF-1α)是調(diào)節(jié)細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)的核心調(diào)控因子［2-3］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylases domain-containing protein，PHD)抑制劑二甲氧乙二酰甘氨酸(dimethyloxallyl glycine，DMOG)預(yù)處理可穩(wěn)定腎小管上皮細(xì)胞HIF-1α 表達(dá)，減輕腎IRI［4-5］，但關(guān)于其晚期腎保護(hù)作用及其機(jī)制研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在證實(shí)DMOG 預(yù)處理對(duì)小鼠腎IRI 的晚期保護(hù)作用，并利用誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric-oxide synthase，iNOS)特異性抑制劑干預(yù)的方法探討iNOS 在此過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 雄性C57BL/6N 小鼠24 只，體質(zhì)量22 ～26 g(SPF 級(jí)，中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，隨機(jī)分為4 組:假手術(shù)(sham)組、IRI 組、DMOG 預(yù)處理組(DMOG + IRI)和GW274150 干預(yù)組(GW274150+DMOG+IRI)，每組各6 只。

1.2 模型制作 2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，取腹正中切口，鈍性分離腎蒂，無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)腎蒂造成腎缺血，持續(xù)夾閉30 min 后松開(kāi)動(dòng)脈夾，恢復(fù)血流，觀察1 min，腎臟由暗紫色逐漸轉(zhuǎn)為鮮紅色，表明再灌注成功，縫合傷口。sham 組只分離腎蒂，然后關(guān)腹;DMOG 預(yù)處理組在缺血術(shù)前24 h 腹腔注射DMOG (40 mg/kg，Cayman 公司，美國(guó));GW274150 干預(yù)組在DMOG 預(yù)處理后的術(shù)前30 min予腹腔注射iNOS 特異性抑制劑GW274150(10 mg/kg，Enzo Life Sciences，美國(guó))。缺血再灌注24 h 后，采血并處死小鼠，留取腎組織備用。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 腎功能檢測(cè):眶下靜脈叢采血，分離血清，酶法測(cè)定小鼠血清肌酐(SCr)濃度(日立全自動(dòng)生化分析儀)。

1.3.2 腎組織病理學(xué)檢查:10%中性甲醛固定腎組織，制作石蠟切片，常規(guī)HE 染色，顯微鏡下觀察腎臟病理改變。根據(jù)腎小管細(xì)胞扁平、管腔擴(kuò)張、細(xì)胞脫落壞死、腎小管管型堵塞、間質(zhì)水腫，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及出血等觀察腎小管間質(zhì)損傷情況。

1.3.3 Western blot 檢測(cè):分別提取組織核蛋白和總蛋白，BCA 法測(cè)定組織蛋白濃度。行PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，鼠抗HIF-1α 單克隆抗體(Novus Biologicals 公司，美國(guó))或兔抗iNOS 多克隆抗體(Cell Signaling Technology 公司，美國(guó))或兔抗Actin 多克隆抗體(Sigma-Aldrich，美國(guó))4 ℃孵育過(guò)夜，TPST 洗膜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠或羊抗兔lgG(Jackson公司，美國(guó))37 ℃孵育1 h，曝光、顯影、成像。應(yīng)用圖像分析軟件對(duì)HIF-1α 和iNOS 特異性條帶進(jìn)行吸光度分析。

1.3.4 細(xì)胞凋亡的檢測(cè):采用脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(Tunel 法)，按試劑盒(Roche公司，德國(guó))說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。每一切片選取10 個(gè)視野，在200 倍光鏡下，盲法觀察染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間的比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠腎功能測(cè)定 與sham 組相比，IRI 組小鼠SCr 明顯升高;DMOG 預(yù)處理可降低IRI 小鼠的SCr 水平;然而，如果在IRI 前事先應(yīng)用iNOS 特異性抑制劑GW274150 可使DMOG 預(yù)處理小鼠SCr 升高。見(jiàn)表1。

2.2 各組小鼠腎臟病理學(xué)改變 HE 染色結(jié)果顯示，IRI 組小鼠腎組織病理學(xué)改變明顯，受損部位集中在外髓內(nèi)帶的近端小管，主要表現(xiàn)為刷狀緣脫落，腎小管細(xì)胞扁平、脫落，管腔擴(kuò)張，腎小管管腔內(nèi)被管型堵塞，間質(zhì)水腫，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和出血;DMOG 預(yù)處理組腎組織病理學(xué)改變較IRI 組顯著改善;iNOS 特異性抑制劑GW274150 干預(yù)則使DMOG 預(yù)處理小鼠腎組織損傷加重。見(jiàn)圖1。

圖1 4 組小鼠腎組織病理光鏡下改變(HE，×200)

2.3 各組小鼠腎組織細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 結(jié)合蘇木素染色結(jié)果顯示，sham 組小鼠腎組織腎組織中僅見(jiàn)少量腎小管上皮細(xì)胞凋亡;IRI 組小鼠腎小管上皮細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的凋亡跡象，凋亡細(xì)胞主要集中在皮髓交界、髓質(zhì)，DMOG 預(yù)處理組腎組織細(xì)胞凋亡數(shù)目較IRI 組明顯減少;iNOS 特異性抑制劑GW274150 干預(yù)可使DMOG 預(yù)處理小鼠腎組織細(xì)胞凋亡數(shù)目增加。見(jiàn)圖2及表1。

圖2 各組小鼠腎組織細(xì)胞凋亡情況(×200)

2.4 DMOG 預(yù)處理24 h 后小鼠腎組織中的HIF-1α蛋白的表達(dá) 小鼠予腹腔注射40 mg/kg 的DMOG 進(jìn)行預(yù)處理，24 h 后小鼠腎組織中HIF-1α 蛋白表達(dá)較注射磷酸鹽緩沖液的對(duì)照小鼠明顯增加［(2.36 ±0.25)%比(0.57 ±0.06)%，P ＜0.05］。見(jiàn)圖3。

圖3 HIF-1α Western blot 檢測(cè)結(jié)果

2.5 4 組小鼠腎組織中iNOS 蛋白的表達(dá) sham 組幾乎沒(méi)有iNOS 表達(dá)，IRI 組iNOS 表達(dá)增加，DMOG 預(yù)處理后iNOS 進(jìn)一步增加，DMOG 預(yù)處理前予iNOS 特異性抑制劑GW274150 可減弱iNOS 的表達(dá)。見(jiàn)圖4及表1。

圖4 iNOS Western blot 檢測(cè)結(jié)果

表1 各組小鼠SCr 水平、腎組織細(xì)胞凋亡水平及iNOS 蛋白的表達(dá)(±s，n=6)

表1 各組小鼠SCr 水平、腎組織細(xì)胞凋亡水平及iNOS 蛋白的表達(dá)(±s，n=6)

注:與sham 組比較，△P ＜0.05;與IRI 組比較，* P ＜0.05;與GW274150干預(yù)組比較，#P ＜0.05

組別SCr(μmol/L) 細(xì)胞凋亡(%)iNOS/Actin sham 組9.8 ±2.22.6 ±1.30.21 ±0.03 IRI 組238.7 ±32.5△ 26.0 ±3.6△ 0.78 ±0.16△DMOG 預(yù)處理組12.3 ±3.6* #8.2 ±1.5* # 1.62 ±0.25* #GW274150 干預(yù)組162.2 ±31.417.3 ±2.51.09 ±0.18

3 討論

過(guò)去的20 年中，人們對(duì)細(xì)胞缺血缺氧環(huán)境下的適應(yīng)性反應(yīng)進(jìn)行了不少研究，但其機(jī)制仍未完全闡明。HIF-1 是哺乳動(dòng)物細(xì)胞低氧應(yīng)答的核心調(diào)節(jié)因子，由α亞基和β 亞基組成，其中α 亞基是低氧調(diào)控的功能性亞基。常氧條件下，HIF-1 極不穩(wěn)定，通過(guò)脯氨酸羥化酶羥基化啟動(dòng)泛素-蛋白酶體途徑迅速發(fā)生降解;缺氧條件下，脯氨酸羥化酶功能喪失，阻斷了HIF-1α 羥基化降解，積聚的HIF-1α 轉(zhuǎn)位入核，與HIF-1β 結(jié)合，啟動(dòng)一系列下游功能基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，以適應(yīng)低氧環(huán)境。截止目前，已發(fā)現(xiàn)受其調(diào)控的靶基因多達(dá)百余種，它們?cè)谘苄律?、糖代謝及細(xì)胞生存、增殖和凋亡等過(guò)程中發(fā)揮極其重要的作用［6-7］。我們前期研究證實(shí)，通過(guò)預(yù)處理穩(wěn)定腎小管上皮細(xì)胞HIF-1α 的表達(dá)，可以模擬缺血預(yù)適應(yīng)，增強(qiáng)腎小管上皮細(xì)胞對(duì)IRI 的耐受，減輕腎小管上皮凋亡，其機(jī)制可能與HIF-1α 激活后促進(jìn)了一系列保護(hù)基因如血紅素氧合酶-1(heme oxygenase，HO-1)、促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)和熱休克蛋白70(heat shock protein，HSP70)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)有關(guān)［4-5］。

缺血預(yù)適應(yīng)的保護(hù)作用具有雙時(shí)相性，根據(jù)時(shí)間早晚分為早期缺血預(yù)適應(yīng)和晚期缺血預(yù)適應(yīng)。早期缺血預(yù)適應(yīng)在預(yù)缺血幾分后即可出現(xiàn)，一般持續(xù)2 ～4 h;晚期缺血預(yù)適應(yīng)在缺血預(yù)處理12 ～24 h 后出現(xiàn)，能持續(xù)幾天甚至數(shù)周［8］;同樣，藥物預(yù)處理也存在這種晚期腎保護(hù)作用，但關(guān)于DMOG 晚期腎保護(hù)作用及其機(jī)制研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)表明，DMOG 通過(guò)改善IRI小鼠的腎功能，減輕腎組織病理學(xué)損傷，減少腎組織細(xì)胞凋亡，對(duì)小鼠腎IRI 產(chǎn)生晚期保護(hù)作用。

機(jī)體中存在3 種一氧化氮合酶:內(nèi)皮型(endothelial NOS，eNOS)、神經(jīng)型(neuronal NOS，nNOS)和誘導(dǎo)型(iNOS)。iNOS 刺激后釋放一氧化氮(NO)較慢，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，既往研究證實(shí)，iNOS 是晚期預(yù)適應(yīng)的觸發(fā)和調(diào)節(jié)因子，它參與了缺血預(yù)處理及多種藥物預(yù)處理的晚期心、腎保護(hù)作用［8-10］。GW274150 是一種特異性iNOS 抑制劑，對(duì)于其他2 種一氧化氮合酶幾乎沒(méi)有作用。本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)Western blot 方法檢測(cè)了iNOS 在各組小鼠腎組織中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IRI 組存在一定程度的iNOS 表達(dá)，DMOG 預(yù)處理后iNOS 增加更加明顯，而DMOG 預(yù)處理后予GW274150 可明顯減弱小鼠IRI 腎組織中iNOS 的表達(dá)。由此說(shuō)明，iNOS 特異性抑制劑GW274150 可大大削弱脯氨酸羥化酶抑制劑DMOG 對(duì)小鼠IRI 的晚期保護(hù)作用。

iNOS 主要通過(guò)合成NO 來(lái)發(fā)揮作用。NO 可以激活鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，產(chǎn)生環(huán)鳥(niǎo)苷酸(cGMP)，進(jìn)而激活蛋白激酶G 并通過(guò)開(kāi)放線粒體鉀通道而產(chǎn)生腎保護(hù)作用［8］。值得指出的是，低水平的NO 對(duì)腎臟具有保護(hù)作用，而過(guò)高水平的NO 將對(duì)腎臟具有損傷作用，我們推測(cè)DMOG 預(yù)處理恰恰是產(chǎn)生了中等程度的iNOS/NO，進(jìn)而啟動(dòng)保護(hù)性信號(hào)途徑對(duì)抗之后的腎IRI。另外，有報(bào)道，常氧條件下，NO 供體可刺激HIF-1α 表達(dá)［11］。因此，我們推測(cè)DMOG 預(yù)處理可穩(wěn)定HIF-1α，促進(jìn)HIF-1α 靶基因iNOS 表達(dá)，使NO 合成增多，進(jìn)而通過(guò)陽(yáng)性反饋?zhàn)饔眠M(jìn)一步觸發(fā)HIF-1α 活化，放大其腎保護(hù)作用。

總之，本研究提示了DMOG 預(yù)處理對(duì)小鼠IRI 腎臟產(chǎn)生晚期保護(hù)作用，iNOS 特異性抑制劑可削弱這種保護(hù)性作用，這意味著iNOS 參與了HIF-1α 活化引發(fā)的腎保護(hù)作用。

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