米 智，阮成龍，李姣蓉，付巧娟，杜文華，李冠楠，隆耀航，朱 勇

(西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400716)

近年來(lái)隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，陶瓷、磚瓦、磷肥、煉鋁、水泥、玻璃、火力發(fā)電和金屬冶煉等部門(mén)排放以氟化物為主的大氣污染給蠶桑生產(chǎn)帶來(lái)的危害越來(lái)越大。氟化物是一類(lèi)原生質(zhì)毒劑，研究表明，氟化物隨桑葉進(jìn)入蠶體累積于消化液、腸壁和體壁等處，通過(guò)消化管進(jìn)入血液，在血液和組織中與蛋白質(zhì)結(jié)合，抑制生長(zhǎng)發(fā)育，出現(xiàn)氟中毒癥狀［1］。氟中毒能損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，內(nèi)分泌系統(tǒng)及心、肝、腎等，并引起生物酶學(xué)改變和免疫功能改變［2］。

酯酶是昆蟲(chóng)體內(nèi)一種重要的代謝酶，屬于水解酶，具有廣泛的底物專(zhuān)一性。一方面殺蟲(chóng)劑對(duì)酯酶活性有抑制作用，另一方面酯酶可對(duì)某些殺蟲(chóng)劑進(jìn)行代謝［3-4］。羧酸酯酶(Carboxylesterase，CarE，EC3.1.1)是一種解毒水解酶。能夠與進(jìn)入昆蟲(chóng)體內(nèi)的有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑快速結(jié)合，將殺蟲(chóng)劑在到達(dá)靶標(biāo)作用位點(diǎn)之前阻隔或降解，降低殺蟲(chóng)劑對(duì)昆蟲(chóng)的毒害，使昆蟲(chóng)產(chǎn)生抗性［5-6］。CarE能夠催化酯類(lèi)和酰胺類(lèi)化合物水解，在神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞過(guò)程中起重要作用［7］。在抗性昆蟲(chóng)中，CarE活性的提高主要是由基因擴(kuò)增使得表達(dá)量的增加(量變)或催化效率提高(質(zhì)變)所引起的［8-11］。傳統(tǒng)方法主要通過(guò)單個(gè)基因的克隆、表達(dá)和突變分析等，來(lái)研究基因在抗性形成中的作用［12-15］。

本試驗(yàn)通過(guò)研究家蠶添食NaF后血液中全酯酶和CarE的活性變化，為從生理生化水平上闡明家蠶對(duì)氟化物的代謝機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

家蠶耐氟品種T6、敏感品種734，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所提供，西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院家蠶遺傳育種室保存。按照常規(guī)方法飼養(yǎng)到5齡起蠶時(shí)，對(duì)照組喂食清水浸泡11 min后自然晾干的新鮮桑葉，試驗(yàn)組分別用50、100、200、400 mg/kg NaF溶液浸泡11 min后自然晾干的桑葉飼養(yǎng)［16］，每隔8 h添食1次，每天添食3次。試驗(yàn)采用平行設(shè)計(jì)，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。從5齡起蠶第1—7天每天分別取各組幼蟲(chóng)的血液樣品。

1.2 家蠶血液酶液的制備

將蠶體表用蒸餾水擦洗處理后，并用吸水紙擦干，使蠶體彎曲，用無(wú)菌剪刀剪其腹足讓血液滴入放有少許苯基硫脲的預(yù)冷離心管中，在0—4℃，5000r/min離心15min，取上清液用0.04mol/L pH7.0的PBS稀釋50倍作為酶液，放置于-70℃冰箱內(nèi)備用。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 羧酸酯酶標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

取 7 個(gè)干燥潔凈的試管依次分別加入 1×10-4mol/L α-萘酚 0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，對(duì)應(yīng)加0.04mol/L pH7.0 磷酸緩沖液 6.0、5.8、5.6、5.2、4.8、4.4、4.0mL，然后分別加入顯色劑(1% 固藍(lán) B 鹽(需避光保存)和5%SDS按2∶5混合，現(xiàn)配現(xiàn)用)1mL，搖勻后30℃水浴保溫30 min，在600 nm處測(cè)定OD值，重復(fù)3次，以O(shè)D600的平均值為縱坐標(biāo)，α-萘酚的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。所得方程為:y=30.99x-0.008，R2=0.999。

1.3.2 家蠶血液羧酸酯酶活性測(cè)定

參照Van Aspern［17］的方法適當(dāng)修改后進(jìn)行，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。2500μL 3×10-4mol/L的α-醋酸萘酯溶液(含1×10-4mol/L毒扁豆堿)和500 μL工作酶液(20 μL酶液和480 μL 0.04mol/L pH 7.0 PBS)混合，在30℃水浴中反應(yīng)30min后，加入500 μL顯色劑后，搖勻，靜置15min，待溶液變成穩(wěn)定的藍(lán)色后，用分光光度計(jì)在600nm處測(cè)OD值。根據(jù)30min內(nèi)生成的α-醋酸萘酚的毫摩爾數(shù)表示酶的活性(μmol/mL α-萘酚)。

1.3.3 家蠶血液全酯酶活性測(cè)定

同羧酸酯酶測(cè)定方法［17］基本一樣，只是在α-醋酸萘酯溶液中不加毒扁豆堿溶液。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel軟件對(duì)CarE和全酯酶活性做柱狀圖分析;運(yùn)用SPSS17.0軟件對(duì)CarE和全酯酶的活性采用Duncan方法進(jìn)行多重比較，比較的顯著水平為P=0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 氟化物對(duì)家蠶血液CarE活性的影響

2.1.1 相同暴露濃度下的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系

整體上來(lái)看，734、T6各濃度NaF處理組的前3d CarE活性都很平穩(wěn)，734的400mg/kg NaF處理組在第2天酶活性上升的幅度較大，其余各濃度處理組在第2天稍有上升;T6的100mg/kg NaF處理組在第2天呈上升趨勢(shì)，其余各濃度處理組在第2天略呈下降趨勢(shì)。在后4d內(nèi)734各濃度NaF處理組的CarE活性變化范圍較大，第4天的酶活性均高于前3d的，且對(duì)照組、100、400mg/kg NaF處理組均出現(xiàn)了峰值;第5天的50mg/kg NaF處理組的酶活性仍上升，200mg/kg NaF處理組的酶活性略呈下降趨勢(shì)，其余各組下降幅度較大;最后2d內(nèi)，對(duì)照組、200、400mg/kg NaF處理組呈上升趨勢(shì)，50mg/kg NaF處理組在第6天下降，第7天上升，100mg/kg NaF處理組呈平緩的下降趨勢(shì)。T6各處理組的CarE活性與734相比較平穩(wěn)，對(duì)照組在第6天的CarE活性最高，達(dá)12μmol/mL，其余時(shí)間段均小于8μmol/mL;50mg/kg NaF處理組在4-6d內(nèi)呈下降趨勢(shì)，第7天活性又上升;100mg/kg NaF處理組在第4天活性最高，最后3d活性很平穩(wěn)，約3μmol/mL;200mg/kg NaF處理組在4—5d的酶活性較平穩(wěn)，在6—7d時(shí)酶活性上升，且達(dá)最大值;400mg/kg NaF處理組在4—7d內(nèi)CarE活性一直很平穩(wěn)，在2—5μmol/mL之間波動(dòng)。

2.1.2 同一暴露時(shí)間內(nèi)的濃度效應(yīng)關(guān)系

添氟處理1d后，734隨著添氟濃度的增加，CarE活性呈先降后升再降的變化趨勢(shì)，而T6呈先降后升的趨勢(shì);添氟處理2d后，734CarE活性隨著添氟濃度的增加呈先降后升的趨勢(shì)，T6的100mg/kg NaF處理組的活性稍高于其他處理組，其余各組的活性均很相近;添氟處理3d后，734的400mg/kg NaF處理組的CarE活性顯著低于其他處理組，其余各組的活性很平穩(wěn)，T6的50mg/kg NaF處理組低于其他各處理組;添氟處理4d后，734各處理組的變化范圍較大，呈“W”型，T6的2個(gè)高濃度添氟組的酶活性低于其余3個(gè)處理組;添氟處理5d后，734各處理組的變化仍很大，呈“M”型，且50mg/kg NaF處理組的酶活性最高，T6添氟組的酶活性低于對(duì)照組，100mg/kg NaF處理組的酶活性最低;添氟處理6d后，734呈現(xiàn)先降后升再降的趨勢(shì)，且400mg/kg NaF處理組的酶活性最低，T6添氟組的酶活性顯著低于對(duì)照組;添氟處理7d后，734和T6添氟組的變化趨勢(shì)基本一致，734對(duì)照組的酶活性最高，而T6對(duì)照組的酶活性最低。

圖1 734的5齡幼蟲(chóng)添食NaF后血液CarE活性的變化Fig.1 Variations of CarE activity of hemolymph in 5th instar larvae of Bombyx mori 734 after treatment with NaF

2.2 添食氟化物對(duì)家蠶血液全酯酶活性的影響

2.2.1 相同暴露濃度下的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系

對(duì)照組中，734全酯酶活性前2d呈下降趨勢(shì)，后5d里酶活性變化很平穩(wěn)略高于前2d，T6隨添氟時(shí)間的增加酶活性呈上升趨勢(shì)，且在第4、7天分別出現(xiàn)峰值;50mg/kg NaF處理組，734前4d呈先降后升的趨勢(shì)，后3d酶活性呈平緩的下降趨勢(shì)，T6整體上呈上升趨勢(shì)，在第2、4、7天出現(xiàn)峰值;100 mg/kg NaF處理組，734前3d呈平緩的下降趨勢(shì)，后4d呈波浪式變化，T6前3d全酯酶活性較相似，第4天出現(xiàn)一個(gè)上升的峰值，后3d呈上升的趨勢(shì);200 mg/kg NaF處理組，734在試驗(yàn)期酶活性基本相似，僅在第1、4天略高于其它時(shí)間點(diǎn)，T6前3d酶活性很平穩(wěn)，第4天酶活性稍升高，后3d酶活性呈上升趨勢(shì);400 mg/kg NaF處理組，734第6天全酯酶活性顯著低于其他時(shí)間點(diǎn)，其余6d的酶活性在62—64μmol/mL之間波動(dòng)，T6的全酯酶整體上呈平穩(wěn)的上升趨勢(shì)。

圖2 T6的5齡幼蟲(chóng)添食NaF后血液CarE活性的變化Fig.2 Variations of CarE activity of hemolymph in 5th instar larvae of Bombyx mori T6 after treatment with NaF

2.2.2 同一暴露時(shí)間內(nèi)的濃度效應(yīng)關(guān)系

添氟處理1d后，734的50mg/kg NaF處理組的酶活性最低，之后隨著添氟濃度增加，酶活性升高，但400 mg/kg NaF處理組的酶活性低于200 mg/kg NaF處理組，T6各濃度之間的酶活性幾乎為一直線(xiàn)，50 mg/kg NaF處理組略低于其它處理組，100 mg/kg NaF處理組略高于其他組;添氟處理2d后，734對(duì)照組和50 mg/kg NaF處理組的全酯酶活性呈下降趨勢(shì)，之后隨著濃度的增加酶活性增加，T6各濃度的酶活性約為一直線(xiàn)，50 mg/kg NaF處理組酶活性略高于其它組，200 mg/kg NaF處理組略低于其它組;添氟處理3d后，734全酯酶的變化趨勢(shì)同處理2d后相似，T6各處理組酶活性幾乎仍是一直線(xiàn)，呈稍稍下降趨勢(shì);添氟處理4d后，734對(duì)照組和兩個(gè)低濃度組呈下降趨勢(shì)，200 mg/kg NaF處理組略上升，而400 mg/kg NaF處理組又下降，T6對(duì)照組和兩個(gè)低濃度的酶活性相當(dāng)，但遠(yuǎn)大于兩個(gè)高濃度處理組的活性;添氟處理5d后，734的酶活性變化同處理4d后，T6隨著濃度的增加呈下降趨勢(shì);添氟處理6d后，734對(duì)照組和兩個(gè)低濃度處理組的酶活性變化較平穩(wěn)，而兩個(gè)高濃度組的酶活性呈驟降趨勢(shì)，T6全酯酶活性同添氟處理5d后的變化趨勢(shì);添氟處理7d后，734全酯酶活性變化較平穩(wěn)，幾乎呈一直線(xiàn)，而T6對(duì)照組的酶活性最高，50、100和200mg/kg NaF處理組酶活性很平穩(wěn)，400mg/kg NaF處理組酶活性驟降。

圖3 734的5齡幼蟲(chóng)添食NaF后血液全酯酶活性的變化Fig.3 Variations of esterase activity of hemolymph in 5th instar larvae of Bombyx mori 734 after treatment with NaF

2.3 不同濃度氟化物及氟化物處理后不同天數(shù)的CarE活性差異分析

734的兩個(gè)低濃度添氟組不僅和對(duì)照組而且與兩個(gè)高濃度添氟組之間的差異均極顯著，但對(duì)照組與高濃度添氟組之間的差異不顯著;而T6各處理組之間的差異均不顯著。2品種間在各個(gè)添氟濃度下的差異極顯著(表1)。

734的CarE活性在添氟后4、6、7d與其他時(shí)間點(diǎn)差異極顯著，而且第7天與前6d的酶活性差異也極顯著，T6在添氟處理后7d內(nèi)的CarE活性差異均不顯著。2品種添氟后1d和3d差異不顯著，其余各時(shí)間點(diǎn)差異極顯著(表2)。

圖4 T6的5齡幼蟲(chóng)添食NaF后血液全酯酶活性的變化Fig.4 Variations of esterase activity of hemolymph in 5th instar larvae of Bombyx mori T6 after treatment with NaF

表1 734與T6添食不同濃度氟化物后CarE和全酯酶活性多重比較Table 1 Multiple comparison on activity variations of CarE and esterase between 734 and T6 after treatment with different sodium fluoride

表2 734與T6添食NaF后不同時(shí)間段CarE和全酯酶活性多重比較Tabel 2 Multiple comparison on activity variations of CarE and esterase at different time between 734 and T6 after treatment with sodium fluoride

2.4 不同濃度氟化物及氟化物處理后不同天數(shù)的全酯酶活性差異分析

734各處理組之間的差異均不顯著，T6對(duì)照組與高濃度添氟組差異極顯著，2品種在同一添氟濃度間的差異極顯著(表1)。

734在添氟后第2天與第4、5、7天差異極顯著，T6添氟分為1—3d、4—6d和7d三組，三組之間的差異極顯著，組內(nèi)差異不顯著。2品種在添氟處理后的各個(gè)時(shí)間段差異極顯著(表2)。

3 討論

CarE是多功能家族酶，普遍存在于動(dòng)物、植物、昆蟲(chóng)和微生物中，并在異生物質(zhì)(藥物、殺蟲(chóng)劑、致癌物等)的解毒、信息素的降解、神經(jīng)的發(fā)生和調(diào)控中扮演著重要角色［18］。CarE水解包含羧酸酯、酰胺和硫酯等官能團(tuán)的化學(xué)物質(zhì)，在藥物代謝和殺蟲(chóng)劑解毒方面發(fā)揮著重要的作用［19］。二斑葉螨(Tetranychus urticae)對(duì)殺螨劑的抗性通常與體內(nèi)解毒酶［20-22］(酯酶、多功能氧化酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)的變化有關(guān)，也涉及靶標(biāo)不敏感機(jī)制［23］。Van Leeuwen等［24］測(cè)定了田間多抗二斑葉螨酯酶活性，發(fā)現(xiàn)抗性種群中的酶活性較敏感品系為高。Achaleke等［25］發(fā)現(xiàn)抗擬除蟲(chóng)菊酯的棉鈴蟲(chóng)酯酶活性高于敏感品系。很多學(xué)者用不同昆蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)同樣得出了CarE活力與擬除蟲(chóng)菊酯和有機(jī)磷的抗性成正相關(guān)，分子生物學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)，酯酶活性的升高是由于酯酶結(jié)構(gòu)基因的擴(kuò)增［26］。而本實(shí)驗(yàn)對(duì)家蠶進(jìn)行添食NaF，檢測(cè)其血液中的CarE活性，得到了與其相反的結(jié)論，原因可能是氟化物和常用的有機(jī)殺蟲(chóng)劑在化學(xué)結(jié)構(gòu)上有本質(zhì)區(qū)別，殺蟲(chóng)劑進(jìn)入昆蟲(chóng)體內(nèi)后，抑制了靶酶正常的生理功能，或作用于神經(jīng)軸突阻斷了神經(jīng)傳導(dǎo)或產(chǎn)生毒素而導(dǎo)致昆蟲(chóng)死亡，而氟化物可能是酶的抑制劑，替換了酶活性位點(diǎn)中的某些離子，使酶活性下降。也可能與CarE表達(dá)和活性存在物種和組織特異性有關(guān)［27］。734在1—3d時(shí)，各處理組(400 mg/kg NaF處理組除外)的CarE活性變化平穩(wěn)，且添氟組的活性低于對(duì)照組，因?yàn)樾Q體自身的免疫系統(tǒng)可以在短時(shí)間內(nèi)抵抗毒物的危害，各種與解毒相關(guān)的酶在此期間發(fā)揮其相應(yīng)的作用［28］，但在4—7d時(shí)，各個(gè)添氟處理組的CarE活性出現(xiàn)無(wú)規(guī)律大幅度的變化，尤其400 mg/kg NaF處理組，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期波動(dòng)范圍最大，高濃度NaF處理則能引發(fā)蠶體短時(shí)間中毒，進(jìn)而導(dǎo)致蠶體代謝系統(tǒng)紊亂，氟可能以間接的方式，在高劑量下擾亂酶系統(tǒng)已被報(bào)道［29］。734的兩個(gè)低濃度添氟組的活性不僅和對(duì)照組而且與兩個(gè)高濃度添氟組之間的差異均極顯著(P＜0.01)。T6各處理組酶活性差異不顯著。

酯酶是昆蟲(chóng)體內(nèi)一種重要的解毒酶系，它可以通過(guò)水解酯類(lèi)毒性化合物的酯鍵，或與親脂類(lèi)有毒化合物結(jié)合，降低其有效濃度來(lái)降低有毒化合物的毒性。因此，酯酶在昆蟲(chóng)對(duì)這幾類(lèi)殺蟲(chóng)劑的抗性中起著重要的作用［30-31］。T6和734添食NaF后全酯酶的平均活性都表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，說(shuō)明NaF對(duì)家蠶血液全酯酶的活性也起到抑制作用。734的50 mg/kg添氟組在1—3d的酶活性處于最低，推測(cè)可能是低濃度的NaF在短期內(nèi)對(duì)敏感品種家蠶全酯酶的抑制作用很大，而高濃度NaF使蠶體及早進(jìn)入各項(xiàng)防御應(yīng)激措施，避免受到嚴(yán)重?fù)p害。T6兩個(gè)高濃度添氟組在2—7d內(nèi)的全酯酶活性一直低于其他處理組，在6—7d最高濃度添氟組的全酯酶活性遠(yuǎn)低于其他處理組，長(zhǎng)時(shí)間添食高濃度的氟化物，會(huì)嚴(yán)重抑制蠶體全酯酶的活性，影響蠶體正常生長(zhǎng)發(fā)育，甚至死亡。整體上T6各處理組的全酯酶活性在4—7d的活性要高于前3d的活性，隨著時(shí)間的增加，蠶體要為進(jìn)入化蛹階段做準(zhǔn)備，故要提高各種解毒酶的活性或增加各種解毒酶的量來(lái)作用氟化物。T6與734兩品種的全酯酶在相同時(shí)間點(diǎn)活性差異均極顯著(P＜0.01)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不論是CarE還是全酯酶，734的酶活性要大于T6，可能是敏感品種在NaF作用下，蠶體需要大量的解毒酶或提高相關(guān)酶活性來(lái)代謝或作用于NaF，而耐氟品種其蠶體本身對(duì)NaF的代謝或抵抗能力很強(qiáng)，故其酶活性低于敏感品種，推測(cè)家蠶血液中的CarE和全酯酶活性與蠶體的耐氟性能有一定的相關(guān)性，但這2種酶在家蠶對(duì)氟化物代謝過(guò)程中的作用機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。

致謝:感謝西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院朱勇教授對(duì)實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)。

［1］Huang J T，Zhu W M，Xia J G，Xiang Z H.Complete Work of Sericultural Technology in China.Chengdu:Sichuan Publishing House of Science＆Technology，1996:462-467.

［2］Zhang P.Research Progress on Fluorine of the Hereditary Toxicity.livestock and poultry industry，2009，238(2):42-44.

［3］Ownsu E O，Horiike M，Hirano C.Polyacrylamide Gel Electrophoretic Assessments of Esterases in Cotton Aphid(Homoptera:Aphididae)Resistance to Dichlorvos.Journal of Economic Entomology，1996，89(2):302-306.

［4］Ownsu E O，Horiike M，Hirano C.Inhibition by insecticides of partially purified Carboxylesterases from Aphis gossypii(Homoptera:Aphididae).Journal of Economic Entomology，1996，89(2):307-310.

［5］Gopalan N，Bhattacharya B K，Prakash S，Rao K M.Characterization of Carboxylesterases from Malathion-Resistant Culex quinquefasciatus Say(Diptera:Culicidae)Mosquitoes.Pesticide Biochemistry and Physiology，1997，57(2):99-108.

［6］Karunaratne S H，Jayawardena K G，Hemingway J，Ketterman A J.The function of esterases in insecticide resistance in Culex quinquefascitatus mosquitoes from Sri Lanka.Biochemical Society Transactions，1993，21(4):482S.

［7］Li X C，Schuler M A，Berenbaum M R.Molecular Mechanisms of Metabolic Resistance to Synthetic and Natural Xenobiotics.Annual Review of Entomology，2007，52:231-253.

［8］Huang J，Qiao C L.Mechanism and Application of Insect Detoxifcation Enzymes in Bioremediation of Pesticide Contamination.Agro-environmental Protection，2002，21(3):285-287.

［9］Hemingway J.The molecular basis of two contrasting metabolic mechanisms of insecticide resistance.Insect Biochemistry and Molecular Biology，2000，30(11):1009-1015.

［10］Vaughan A，Hemingway J.Cloning and sequence of the full-length cDNA for a major insecticide resistance gene worldwide in the mosquito Culex quinquefasciatus.Journal of Biological Chemistry，1995，270(28):17044-17049.

［11］Vaughan A，Hawkes N，Hemingway J.Co-amplification explains linkage disequilibrium of two mosquito esterase genes in insecticide resistant Culex quinquefasciatus.Biochemical Journal，1997，325(Pt2):359-365.

［12］Zhang L，Shi J，Shi X Y，Liang P，Gao J P，Gao X W.Quantitative and qualitative changes of the carboxylesterase associated with betacypermethrin resistance in the housefly，Musca domestica(Diptera:Muscidae).Comparative Biochemistry and Physiology B-Biochemistry ＆Molecular Biology，2010，56(1):6-11.

［13］Khajuria C，Buschman L L，Chen M S，Siegfried B D，Zhu K Y.Identification of a novel aminopeptidase P-like gene(OnAPP)possibly involved in Bt toxicity and resistance in a major corn pest(Ostrinia nubilalis).PLoS One，2011，6(8):e23983.

［14］Yu X L，Wang M，Kang M J，Liu L，Guo X Q，Xu B H.Molecular cloning and characterization of two nicotinic acetylcholine receptor beta subunit genes from Apis cerana cerana.Archives of Insect Biochemistry and Physiology，2011，77(4):163-178.

［15］Karatolos N，Williamson M S，Denholm I，Gorman K，F(xiàn)french-Constant R H，Bass C.Over-expression of a cytochrome P450 is associated with resistance to pyriproxyfen in the greenhouse whitefly Trialeurodes vaporariorum.PLoS One，2012，7(2):e31077.

［16］Huang L L，Wei B Y，Meng Y Y.Experiment about soaking time of sodium fluoride solution on concentration changes of mulberry leaf containing fluoride.Guangxi Sericulture，2005，42(4):5-7.

［17］Van Asperen K.A study of housefly esterases by means of a sensitive colorimetric method.Journal of Insect Physiology，1962，8(4):401-416.

［18］Yu Q Y，Lu C，Li W L，Xiang Z H，Zhang Z.Annotation and expression of carboxylesterases in the silkworm，Bombyx mori.BMC Genomics，2009，10(1):553.

［19］Yang D F，Pearce R E，Wang X L，Gaedigk R，Wan Y J Y，Yan B F.Human carboxylesterases HCE1 and HCE2:ontogenic expression，interindividual variability and differential hydrolysis of oseltamivir，aspirin，deltamethrin and permethrin.Biochemical Pharmacology，2009，77(2):238-247.

［20］Tsagkarakou A，Pasteur N，Cuany A，Chevillon C，Navajas M.Mechanisms of resistance to organophosphates in Tetranychus urticae(Acari:Tetranychidae)from Greece.Insect Biochemistry and Molecular Biology，2002，32(4):417-424.

［21］Ay R，Yorulmaz S.Inheritance and detoxification enzyme levels in Tetranychus urticae Koch(Acari:Tetranychidae)strain selected with chlorpyrifos.Journal of Pest Science，2010，83(2):85-93.

［22］Ay R，Kara F E.Toxicity，inheritance of fenpyroximate resistance，and detoxification-enzyme levels in a laboratory-selected fenpyroximate-resistant strain of Tetranychus urticae Koch(Acari:Tetranychidae).Crop Protection，2011，30(6):605-610.

［23］Kwon D H，Clark J M，Lee S H.Cloning of a sodium channel gene and identification of mutations putatively associated with fenpropathrin resistance in Tetranychus urticae.Pesticide Biochemistry and Physiology，2010，97(2):93-100.

［24］Van Leeuwen T，Tirry L.Esterase-mediated Bifenthrin Resistance in a Multiresistant Strain of the two-spotted Spider Mite，Tetrancychus urticae.Pest Management Science，2007，63(2):150-156.

［25］Achaleke J，Martin T，Ghogomu R T，Vaissayre M，Brevault T.Esterase-mediated Resistance to Pyrethoids in Field Populations of Helicoverpa armigera(Lepidoptera:Noctuidac)from Central Africa.Pest Management Science，2009，65(10):1147-1154.

［26］Zhai Q H.Some aspects of progress in insect molecular biology:Molecular mechanisms of insecticide resistance.Acta entomologica sinica.1995，38(4):493-501.

［27］Imai T.Human carboxylesterase isozymes:catalytic properties and rational drug design.Drug Metabolism and Pharmacokinetics，2006，21(3):173-185.

［28］Mi Z，Ruan C L，Li G N，Du W H，Long Y H，Zhu Y.Activity Variations of NADPH Cytochrome P450 Reductase and NADPH Cytochrome C Reductase in Midgut of Fluoride Poisoned Bombyx mori.Science of Sericulture，2012，38(1):0102-0108.

［29］Liu Y Q.Mutagenicity of fluoride.Foreign Medical Sciences:Section of Medgeography，1996，17(2):58-60.

［30］Zhang L，Gao X W，Liang P，Beta-cypermethrin resistance associated with high carboxylesterase activities in a strain of house fly，Musca domestica(Diptera:Muscidae).Pesticide Biochemistry and Physiology，2007，89(1):65-72.

［31］Holmes R S，Cox L A，Vandeberg J L.Mammalian Carboxylesterase 5:comparative Biochemistry and Genomics.Comparative Biochemistry and Physiology D-Genomics＆ Proteomics，2008，3(3):195-204.

參考文獻(xiàn):

［1］黃君霆，朱萬(wàn)民，夏建國(guó)，向仲懷.中國(guó)蠶絲大全.成都:四川科學(xué)技術(shù)出版社，1996:462-467.

［2］張平.氟化物遺傳毒性的研究進(jìn)展.畜禽業(yè)，2009，238(2):42-44.

［8］黃菁，喬傳令.昆蟲(chóng)解毒酶解毒機(jī)理及其在農(nóng)藥污染治理中的應(yīng)用.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2002，21(3):285-287.

［16］黃玲莉，韋博尤，蒙藝英.氟化鈉溶液浸泡時(shí)間對(duì)桑葉含氟濃度變化的試驗(yàn).廣西蠶業(yè)，2005，42(4)，5-7.

［26］翟啟慧.昆蟲(chóng)分子生物學(xué)的一些進(jìn)展:殺蟲(chóng)劑抗性的分子基礎(chǔ).昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，1995，38(4):493-501.

［28］米智，阮成龍，李冠楠，杜文華，隆耀航，朱勇.家蠶氟中毒后中腸NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶和NADPH-細(xì)胞色素C還原酶活性的變化. 蠶業(yè)科學(xué)，2012，38(1):0102-0108

［29］劉雨清.氟化物的誘變性.國(guó)外醫(yī)學(xué)(醫(yī)學(xué)地理分冊(cè))，1996，17(2):58-60.