管志美，張德波

（1.湖南省藥品審評認(rèn)證與不良反應(yīng)監(jiān)測中心，長沙 410013；2.成都市食品藥品檢測中心，成都 610000）

使用豚鼠研究藥物的過敏反應(yīng)是常規(guī)實(shí)驗(yàn)手段，但豚鼠全身主動過敏反應(yīng)發(fā)生率是否與試驗(yàn)動物性別有關(guān)、在藥物中添加過敏原對藥物過敏反應(yīng)發(fā)生率有無影響、過敏試驗(yàn)中能否采用再一次激發(fā)的方式來增加過敏反應(yīng)發(fā)生率等問題卻是需要深入研究和探討的。本文對上述問題作了研究與探討，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 試藥與試劑

注射用炎琥寧，性狀：淡黃色塊狀物，規(guī)格80 mg，批號：A－080704；注射用阿奇霉素，性狀：白色疏松塊狀物，規(guī)格0.125g，批號：A－080702。均由峨眉山通惠制藥有限公司生產(chǎn)并提供。

5%葡萄糖注射液，規(guī)格250mL，批號：00706009，青島華仁藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；滅菌注射用水，規(guī)格500mL，批號：A060313，四川科倫藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；卵白蛋白，批號：BP0124，Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

英國種豚鼠，體質(zhì)量300～350g，雌雄均用，由四川省實(shí)驗(yàn)動物專委會養(yǎng)殖場提供。正常飼養(yǎng)5～7d后選擇健康活潑者使用。飼料：全價營養(yǎng)飼料，四川省醫(yī)科院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心生產(chǎn)供應(yīng)部提供。試驗(yàn)在成都市藥物研究所藥理實(shí)驗(yàn)動物室進(jìn)行。上述供貨單位均擁有合法資質(zhì)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 急性毒性試驗(yàn) 取禁食不禁水12h健康活的雄性豚鼠隨機(jī)分為卵白蛋白5mg／mL組、注射用炎琥寧16mg／mL組、注射用阿奇霉素20mg／mL、10mg／mL、5mg／mL組，每組3只。各組動物由趾靜脈注射相應(yīng)的藥液進(jìn)行毒性試驗(yàn)，注射劑體積均為1mL／只。注射后正常飼養(yǎng)，觀察24h，記錄動物發(fā)生的毒性反應(yīng)及死亡情況［1］。

1.3.2 不同性別豚鼠過敏反應(yīng)發(fā)生率比較 取豚鼠，隨機(jī)分為陰性對照組（雌雄各半）、陽性雌性組、陽性雄性組，每組10只。陰性對照組動物給予5%葡萄糖注射液，陽性組均給予用5%葡萄糖注射液配制的0.15mg／mL卵白蛋白液。各組動物均采用腹腔注射法致敏，隔日1次，共4次，每次劑量均為0.5mL／只。于末次致敏后第11天，各組動物分別由趾靜脈注射相應(yīng)的藥液進(jìn)行激發(fā)，劑量均為1 mL／只。激發(fā)注射藥液后觀察60min，并記錄動物反應(yīng)情況及死亡情況。

1.3.3 藥物中添加與不添加過敏原試驗(yàn)比較 1）動物分組及致敏：取雄性豚鼠隨機(jī)分為陰性對照組、陽性對照組、注射用炎琥寧＋卵白蛋白組、注射用炎琥寧組、注射用阿奇霉素組＋卵白蛋白組、注射用阿奇霉素組，每組10只。陰性對照組動物給予5%葡萄糖注射液，陽性組均給予5%葡萄糖注射液配制的0.15mg／mL卵白蛋白液。藥物添加過敏原組均采用藥物中添加卵白蛋白的方法配制，藥物不添加過敏原組均直接用5%葡萄糖注射液配制。各組動物采用腹腔注射法致敏，隔日1次，共4次，每次劑量均為0.5mL／只。2）動物激發(fā)方法：每組動物在末次致敏后第11天由趾靜脈注射給藥激發(fā)，各組動物激發(fā)劑量均為1mL／只。共激發(fā)3次。第1次激發(fā)：陰性對照組給予5%葡萄糖注射液；注射用炎琥寧組、注射用炎琥寧＋卵白蛋白組均給予用5%葡萄糖注射液配制的4mg／mL注射用炎琥寧液；注射用阿奇霉素組、注射用阿奇霉素＋卵白蛋白組均給予用5%葡萄糖注射液配制的2mg／mL注射用阿奇霉素；陽性組均給予5%葡萄糖注射液配制的0.15mg／mL卵白蛋白液。激發(fā)注射后，觀察3h。第2次激發(fā)：第1次激發(fā)觀察后的注射用炎琥寧＋卵白蛋白組、注射用阿奇霉素＋卵白蛋白組，再用5%葡萄糖注射液配制的卵白蛋白液激發(fā)，激發(fā)注射后觀察1h［2］。第3次激發(fā)：第2次激發(fā)觀察后的注射用炎琥寧＋卵白蛋白組、注射用阿奇霉素＋卵白蛋白組存活動物，再用5%葡萄糖注射液配制的卵白蛋白液激發(fā)；陰性、陽性對照組也用相應(yīng)供試液激發(fā)，激發(fā)劑量均為2mL／只。激發(fā)注射后再觀察3 h。激發(fā)后立即觀察并記錄反應(yīng)情況及死亡情況［3］。

2 結(jié)果

2.1 豚鼠急性毒性試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)表明：卵白蛋白5mg／mL、注射用炎琥寧16mg／mL、注射用阿奇霉素10mg／mL供試液對豚鼠靜脈注射1mL／只不會引起動物發(fā)生毒性反應(yīng)，可用不大于該量的劑量進(jìn)行過敏試驗(yàn)（見表1）。

2.2 不同性別豚鼠過敏反應(yīng)發(fā)生率比較研究

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同性別的豚鼠過敏反應(yīng)發(fā)生率沒有明顯區(qū)別，激發(fā)后過敏反應(yīng)發(fā)生的時間及過敏反應(yīng)的程度均無明顯區(qū)別（見表2）。

表1 豚鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

表2 不同性別豚鼠過敏反應(yīng)發(fā)生率比較

表3 藥液中添加與不添加過敏原試驗(yàn)（第1次激發(fā)）

表4 藥液中添加與不添加過敏原試驗(yàn)（對第1次激發(fā)存活動物用卵白蛋白激發(fā)）

表5 藥液中添加與不添加過敏原試驗(yàn)（對第2次激發(fā)存活動物再次用卵白蛋白激發(fā)）

2.3 藥物中添加與不添加過敏原試驗(yàn)比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，陰性組動物激發(fā)后無過敏反應(yīng)發(fā)生；陽性組動物激發(fā)后全部出現(xiàn)過敏反應(yīng)，并且大部分出現(xiàn)極強(qiáng)陽性（死亡）；藥物＋卵白蛋白組動物用藥液激發(fā)后，動物無過敏反應(yīng)發(fā)生（見表3）；藥物＋卵白蛋白組動物用卵白蛋白液激發(fā)后均出現(xiàn)過敏反應(yīng)，并且部分動物出現(xiàn)極強(qiáng)陽性致死亡（見表4）；藥物＋卵白蛋白組存活動物再次用卵白蛋白液激發(fā)后，動物無明顯過敏反應(yīng)發(fā)生；陽性組存活動物再次出現(xiàn)過敏反應(yīng)（見表5）。

3 討論

本研究對豚鼠全身主動過敏試驗(yàn)的供試品均先做了急性毒性試驗(yàn)，確保過敏試驗(yàn)動物在激發(fā)注射后所產(chǎn)生的反應(yīng)不是供試品毒性作用引起的。本研究對兩種藥品進(jìn)行了溶血與凝聚試驗(yàn)，注射用炎琥寧7mg／mL、注射用阿奇霉素5mg／mL，恒溫3h均未產(chǎn)生溶血與凝聚作用，結(jié)果表明小于該濃度的藥液直接靜脈使用不會引起動物發(fā)生溶血與凝聚作用。性別試驗(yàn)表明，豚鼠的性別與過敏反應(yīng)發(fā)生率并無明顯相關(guān)性；但本研究所用的過敏原卵白蛋白的劑量較大，能使動物發(fā)生強(qiáng)烈的過敏反應(yīng)，當(dāng)過敏原劑量較小，剛能引起動物輕微過敏反應(yīng)時，是否會發(fā)生因動物性別不同而過敏反應(yīng)發(fā)生率不同的現(xiàn)象，值得研究［4］。本研究進(jìn)行了藥物中添加與不添加過敏原試驗(yàn)，目的為：1）考查添加已知的過敏原是否會引起藥物過敏反應(yīng)發(fā)生率增加；2）如果添加過敏原對藥物過敏試驗(yàn)無影響，能否在常規(guī)檢驗(yàn)時將藥物組與陽性對照組合二為一，節(jié)約動物使用數(shù)量。添加與不添加過敏原的試驗(yàn)結(jié)果表明，添加的過敏原－卵白蛋白對注射用炎琥寧和注射用阿奇霉素的過敏試驗(yàn)無影響，但用卵白蛋白液激發(fā)時過敏反應(yīng)程度與陽性組比較有明顯差別，可能是這兩種藥物對混合于供試液中的卵白蛋白有分解或破壞作用，導(dǎo)致供試液中卵白蛋白量減少，因此添加卵白蛋白組動物的致敏效果不如陽性組好。本研究的結(jié)果并不能說明其他藥物中添加過敏介質(zhì)，或炎琥寧和阿奇霉素中添加其他過敏原對藥物的過敏試驗(yàn)無影響。本研究對激發(fā)后3h未死亡的動物進(jìn)行了再激發(fā)，主要是考查當(dāng)提高激發(fā)量時，會不會使動物過敏反應(yīng)更強(qiáng)烈，結(jié)果陽性組動物再激發(fā)后又出現(xiàn)了劇烈的過敏反應(yīng)，表現(xiàn)出過敏反應(yīng)與激發(fā)量多少有正相關(guān)性，這與筆者以前的研究結(jié)果一致。而添加過敏原的藥物組卻未出現(xiàn)這種情況，表明過敏反應(yīng)是否出現(xiàn)，除了與激發(fā)量有較大關(guān)系外，還與致敏量有較大關(guān)系，提示我們在進(jìn)行過敏試驗(yàn)時，無論是致敏還是激發(fā)，試驗(yàn)劑量都要盡可能的大［5］。

目前，有部分血管內(nèi)使用藥品進(jìn)行安全性試驗(yàn)或按標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗(yàn)時動物均未出現(xiàn)過敏反應(yīng)，但臨床應(yīng)用時卻有過敏現(xiàn)象發(fā)生，是否是動物的試驗(yàn)劑量或標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的檢驗(yàn)劑量偏小造成的，值得我們研究。

［1］中華人民共和國藥典委員會.中國藥典（一部）［S］.2005年版，北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005，附錄116.

［2］化學(xué)藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則課題研究組.化學(xué)藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則［S］.國家食品藥品監(jiān)督管理局，2005，3：5，18.

［3］張德波，楊幼琪，馮誠，等.過敏反應(yīng)與致敏劑量和致敏時間的關(guān)系研究［J］.中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2007，8（3）：18－20.

［4］張德波，蒲旭峰，楊奎，等.豚鼠過敏試驗(yàn)方法探討［J］.中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2009，10（2）：112－116.

［5］楊偉峰，余學(xué)釗，何萍，等.丹參滴注液及其組分致豚鼠過敏反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國中藥雜志，2012，37（13）：1894－1897.