吳劍鋒，徐迪暉，趙海金

（1.解放軍廣州療養(yǎng)院，廣州 510515；2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院消化科，廣州 510515；3.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院呼吸科，廣州 510515）

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是各種慢性肝病共有的病理變化，表現(xiàn)為膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)（extracelluar matrix，ECM）在肝臟過度的沉積。肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSCs）的激活是HF的中心關(guān)鍵環(huán)節(jié)，HSCs被激活后，其表型向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，合成大量α－SMA、膠原等基質(zhì)成分而參與HF的發(fā)生發(fā)展［1］。糖尿病和HF關(guān)系密切，一方面慢性肝病可影響糖代謝；另一方面，近年來研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病會促進(jìn)慢性肝病HF的進(jìn)展，是發(fā)生肝硬化的一個重要危險(xiǎn)因素［2，3］。探討高血糖在HF發(fā)病中的作用及其機(jī)制，有助于發(fā)現(xiàn)防治HF的新策略。本實(shí)驗(yàn)通過體外高糖（模擬糖尿病高血糖）處理人HSCs，觀察研究高糖對人HSCs的活化作用及其機(jī)制，為臨床防治糖尿病相關(guān)HF提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

D－葡萄糖、甘露醇購自Sigma Aldrich公司（USA），DMEM培養(yǎng)基以及特級胎牛血清（FBS）購自 Gibco BRL（USA），抗 TGF－β1抗體購自 Abcam（Cambridge，UK，ab64715），抗 MMP－2 抗體購自Sigma Aldrich（St.Louis，MO，SAB4501891），抗I型膠原抗體購自Abcam（ab34710），抗α－SMA抗體購自Santa Cruz Biotechnology（CA，sc－130619）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理方法

HSCs細(xì)胞由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。在37℃、5%CO2的條件下，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。實(shí)驗(yàn)分組：正常對照組（normal glucose group，NG，5.5mmol／L葡萄糖）、高糖組（high glucose group，HG，30mmol／L葡萄糖）和滲透壓對照組（osmolality control group，OC，5.5mmol／L葡萄糖＋19.5mmol／L甘露醇）。

1.3 Western blot測定蛋白的表達(dá)

HSCs細(xì)胞接種于60mm培養(yǎng)皿中，各實(shí)驗(yàn)組給予不同的處理因素后，用預(yù)冷的PBS洗2次，加入細(xì)胞裂解液，4℃靜置30min，12 000r／min離心10min，取上清，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量?？偟鞍捉?jīng)SDSPAGE分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1.5h，隨后加入抗 TGF－β1、MMP－2、I型膠原和α－SMA抗體（1∶1 000），4℃過夜，用TBST洗3次，10min／次。將PVDF膜用發(fā)光試劑ECL顯色，暗室曝光到X線片上，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。

1.4 ELISA法測定TGF－β1的分泌水平

采用雙抗體夾心ABC－ELISA法檢測培養(yǎng)基中TGF－β1的水平。HSCs細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，當(dāng)80%融合時，分別給予不同的條件處理培養(yǎng)基，每組3個復(fù)孔。處理完成后，取100μL培養(yǎng)基加入預(yù)先用TGF－β1抗體包被的酶標(biāo)板中，37℃孵育90min，然后吸出培養(yǎng)基，加入TGF－β1抗體繼續(xù)孵育60min，經(jīng)TBS漂洗3次，加入生物素標(biāo)記的Ⅱ抗，反應(yīng)30min，采用TMB法顯色，經(jīng)終止液終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀（Muhiscan MK3，Thermo Labsystems）記錄450nm波長處的吸光度。取3孔標(biāo)準(zhǔn)化處理后的A值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one－way ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高糖誘導(dǎo)HSCs細(xì)胞α－SMA表達(dá)上調(diào)

高糖處理HSCs細(xì)胞48h后，與NG組比較，α－SMA表達(dá)顯著升高（見圖1）；α－SMA是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志之一，該結(jié)果提示高糖可以誘導(dǎo)HSCs細(xì)胞活化。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。

2.2 高糖引起HSCs細(xì)胞MMP－2和I型膠原表達(dá)上調(diào)

I型膠原是ECM的主要成分，而活化的HSCs細(xì)胞是合成I型膠原的主要細(xì)胞；HSCs細(xì)胞高糖暴露48h后，I型膠原表達(dá)明顯增加（見圖2）。MMP在 HF時表達(dá)升高，其中 MMP－2主要由HSCs細(xì)胞分泌表達(dá)；高糖刺激HSCs細(xì)胞48h，MMP－2表達(dá)顯著升高（見圖3）。

圖1 高糖誘導(dǎo)上調(diào)HSCs細(xì)胞α－SMA的表達(dá)

圖2 高糖增加HSCs細(xì)胞I型膠原的表達(dá)

2.3 高糖促進(jìn)HSCs細(xì)胞TGF－β1的分泌

TGF－β1在器官纖維化中有關(guān)鍵性作用，激活的HSCs細(xì)胞可以分泌 TGF－β1。本研究發(fā)現(xiàn)，HSCs細(xì)胞在高糖刺激48h后，培養(yǎng)上清液中TGF－β1的表達(dá)明顯增加（見圖4）。

圖3 高糖上調(diào)HSCs細(xì)胞MMP－2的表達(dá)

圖4 高糖促進(jìn)HSCs細(xì)胞TGF－β1的產(chǎn)生

3 討論

慢性肝病和各種因素引起的肝損傷，最終修復(fù)創(chuàng)傷的結(jié)果是HF，其本質(zhì)是ECM合成超過降解的病理過程，也是各種肝病和肝損傷導(dǎo)致肝硬化的共同通路［4］。研究證實(shí)，糖尿病高血糖有促進(jìn)肝臟、腎臟和血管等器官纖維化的作用，而HF又影響機(jī)體糖代謝，二者互為因果，相互促進(jìn)［5，6］。糖尿病性肝病作為糖尿病的慢性并發(fā)癥之一，是指糖尿病引起肝臟組織結(jié)構(gòu)和功能的病理變化（包括HF）。

研究證實(shí)，HSCs在HF發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，其激活和增殖是HF的中心環(huán)節(jié)，激活的HSCs表型轉(zhuǎn)變?yōu)榧±w維母細(xì)胞，特異性表達(dá)α－SMA（是HSCs激活的標(biāo)志，在靜止期HSCs中無明顯表達(dá)，也是HSCs激活程度和HF進(jìn)展的一個重要指標(biāo)），合成大量 ECM 促進(jìn) HF［7－9］。

本研究結(jié)果顯示：高糖處理HSCs后可以誘發(fā)α－SMA、I型膠原和 MMP－2表達(dá)上調(diào)，提示高糖可以激活HSCs而促進(jìn) HF；此外，TGF－β1在 HF中有重要作用，可以誘導(dǎo)HSCs表型轉(zhuǎn)變?yōu)榉置谀z原的肌纖維母細(xì)胞，而HSCs也可以分泌TGF－β1，進(jìn)而加重肝細(xì)胞損傷［10］；高糖刺激可以誘導(dǎo)HSCs分泌TGF－β1增加；高糖激活HSCs可能是通過TGF－β1信號通路。

綜上所述，高糖可以激活人HSCs，進(jìn)而促進(jìn)HF的發(fā)生，其機(jī)制可能是通過TGF－β1通路。進(jìn)一步深入研究高血糖和HF相互影響的內(nèi)在機(jī)制，有助于發(fā)現(xiàn)防治糖尿病性HF的新策略，為糖尿病性肝損傷機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］蔡曉波，范建高，田麗艷，等.高血糖大鼠肝纖維肝臟氧化還原狀態(tài)的影響［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2005，21（20）：2725－2726.

［2］范建高，田麗艷，蔡曉波，等.高血糖對四氯化碳中毒大鼠肝纖維化進(jìn)展的影響［J］.中華肝臟病雜志，2006，14（1）：58－60.

［3］蔡曉波，范建高，田麗艷，等.高血糖對大鼠肝星狀細(xì)胞活化及轉(zhuǎn)化生長因子－β1和結(jié)締組織生長因子表達(dá)的影響［J］.肝臟，2006，11（2）：96－97.

［4］李芹，鄧存良，陳莊，等.高糖，胰島素對大鼠肝星狀細(xì)胞增殖影響［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2009，19（11）：1669－1672.

［5］羅潔，許輝，劉毅.高糖高脂誘導(dǎo)新西蘭兔肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究［J］.實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007，14（2）：311－315.

［6］蔡曉波，范建高.高血糖對肝纖維化發(fā)生的影響及其機(jī)制［J］.國外醫(yī)學(xué)（消化系疾病分冊），2005，25（5）：281－283.

［7］劉銀利，吳濤，毛美絨，等.高血糖對大鼠肝纖維化及肝星狀細(xì)胞活化的影響［J］.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2013，22（1）：6－9.

［8］李芹，鄧存良.高血糖，肝星狀細(xì)胞與肝纖維化［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2008，14（6）：888－889.

［9］樊雪強(qiáng)，陳新華，齊曉艷.靶向結(jié)締組織生長因子的siRNA對于肝星狀細(xì)胞介導(dǎo)纖維化的研究進(jìn)展［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，9（35）：55－57.

［10］方瑜潔，萇新明.高血糖對肝纖維化大鼠肝組織α－SMA和CTGF表達(dá)的影響［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2009，11（7）：1－4.