曹 平 趙 玉 張麗麗 沈 婕 鄧蓉蓉 宋志霞 趙俊麗 王 靜

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種多系統(tǒng)損傷的自身免疫性疾病，狼瘡性腎炎(LN)是其最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，累積發(fā)病率亞洲人群最高(55%)，其中23%約10年后進(jìn)展至終末期腎?。?-3］。LN發(fā)病可能與遺傳、激素、感染、環(huán)境等因素有關(guān)。近年研究表明，機(jī)體的遺傳因素在SLE的易感性發(fā)病方面處于主導(dǎo)地位，且是多基因協(xié)調(diào)控制［4，5］，但有關(guān) SLE并發(fā)LN的機(jī)制仍不明確。Kalaaji等［6］研究顯示，SLE患者細(xì)胞凋亡異常介導(dǎo)的核小體與抗核小體抗體間的作用是LN發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。但是，目前對(duì)LN凋亡清除機(jī)制障礙的始動(dòng)原因仍不明確。由于細(xì)胞凋亡是多基因嚴(yán)格調(diào)控的過程，而LN又是多基因表達(dá)異常所致的自身免疫性疾病，因此，對(duì)LN發(fā)病過程中與細(xì)胞凋亡有關(guān)基因的研究，可望成為闡明LN發(fā)病機(jī)制的突破口。還有研究顯示瓣?duì)顑?nèi)切核酸酶1(Fen1)基因的單核苷酸多態(tài)性與SLE有關(guān)［7］，F(xiàn)en1 基因位于人類染色體 11q12，長 1144 bp，含有一個(gè)外顯子，編碼380個(gè)氨基酸，構(gòu)成Fen1核酸酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)，是一種結(jié)構(gòu)特異性多功能核酸酶，在DNA的多條代謝途徑、維護(hù)染色體的穩(wěn)定及細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用［8］。該基因的變異與腫瘤及自身免疫性疾病有關(guān)［9，10］。Zheng 等［10］通過對(duì)Fen1基因E160D點(diǎn)突變模型小鼠研究發(fā)現(xiàn)，該模型小鼠細(xì)胞凋亡的清除機(jī)制發(fā)生障礙，導(dǎo)致凋亡產(chǎn)物在腎臟及肺組織中堆積增多，誘發(fā)自身免疫反應(yīng)，造成腎臟免疫性損傷。我們推測在以細(xì)胞凋亡異常為主導(dǎo)作用的LN發(fā)病機(jī)制中，F(xiàn)en1基因異常可能發(fā)揮了很重要的作用，為此，我們檢測LN患者腎臟組織細(xì)胞凋亡情況和Fen1基因61563142～61563342目的片段，確定其突變及與LN的相關(guān)性。

對(duì)象和方法

對(duì)象 為2009年10月至2012年5月期間蘭州大學(xué)第二醫(yī)院腎內(nèi)科住院確診LN患者50例，(其中女性45例，男性5例，均為漢族，年齡13～50歲，平均年齡33.48歲)，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合1997年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)修訂的SLE分類診斷標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上出現(xiàn)以下四條中的任意一條且排除其他導(dǎo)致腎炎因素：(1)24h尿蛋白定量＞0.5 g/d；(2)尿中紅細(xì)胞或白細(xì)胞＞5個(gè)/HP；(3)血清肌酐(SCr)＞133 μmol/L；(4)腎活檢明確診斷。

健康組選自2009年7月在本院體檢中心進(jìn)行健康檢查的漢族健康者25例(女性14例，男性11例)，年齡21～43歲(平均29.6歲)；胃癌組為2010年10月至2012年5月期間蘭州大學(xué)第二醫(yī)院普外科住院漢族患者20例(女性11例，男性9例)，年齡45～70歲(平均52歲)，所有患者均經(jīng)胃鏡及病理檢查確診而入院接受手術(shù)治療。30例LN患者腎穿刺組織來自于蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理研究所標(biāo)本庫。

主要儀器及試劑 Bio-Rad S1000 PCR儀，JY200 電泳儀，ImageQuant-300，DNA Marker B，柱式全血基因組抽提試劑盒，PCR試劑盒(美國Promega)，凱基TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒。

研究方法

細(xì)胞凋亡檢測 按凱基TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書操作：(1)石蠟切片按常規(guī)方法進(jìn)行脫蠟及水合；(2)切片浸入1×PBS漂洗三次，5 min/次；(3)配制1%Triton X～100通透液；(4)切片浸入通透液中，室溫促滲3～5 min；(5)切片浸入1 ×PBS漂洗三次，5 min/次；(6)配制3%H2O2封閉液；(7)切片浸入封閉液，室溫(15℃～25℃)封閉10 min；(8)切片浸入1×PBS漂洗三次，5 min/次；(9)配制Proteinase K工作液；(10)每個(gè)樣本上滴加100 μl Proteinase K 工作液，37℃反應(yīng) 30 min；(11)切片浸入1×PBS漂洗三次，每次5 min/次；(12)配制100 μl含3000 U 的DNaseⅠ反應(yīng)液；(13)在一張樣本切片上滴加100 μl上述 DNaseⅠ反應(yīng)液，室溫～37℃處理10～30 min；(14)制好的陽性片浸入1×PBS漂洗三次，每次5 min/次；(15)配制 TdT酶反應(yīng)液；(16)樣本周圍用吸水紙吸干，每個(gè)樣本上滴加50 μl TdT酶反應(yīng)液，加蓋玻片放入溫盒中，37℃避光反應(yīng)60 min(陰性對(duì)照樣本不加TdT酶反應(yīng)液)；(17)反應(yīng)后的樣本片浸入1×PBS漂洗三次，5 min/次；(18)配制Streptavidin～HRP工作液；(19)樣本周圍用吸水紙吸干，每個(gè)樣本上滴50 μl Streptavidin～HRP工作液，加蓋玻片放入溫盒中，37℃避光反應(yīng)30 min；(20)反應(yīng)后的樣本片浸入1×PBS漂洗三次，5 min/次；(21)配制DAB工作液；(22)樣本周圍用吸水紙吸干，每個(gè)樣本上滴加50 μl DAB工作液，室溫顯色反應(yīng)30s～5 min；(23)顯色后的樣本片浸入1×PBS漂洗三次，5 min/次，光鏡下觀察、拍照；(24)蘇木素、甲基綠等常規(guī)染液復(fù)染。

計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù) 切片隨機(jī)選5個(gè)視野，每個(gè)視野視察100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算凋亡指數(shù)?；仡櫺苑治瞿I活檢患者的病例資料，根據(jù)ISN/RPS 2003狼瘡性腎炎分型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理分型，應(yīng)用SLE活動(dòng)度評(píng)分(SLEDAI)2000判斷其疾病活動(dòng)度，并進(jìn)行相關(guān)性分析。

標(biāo)本采集 取受檢者清晨空腹外周靜脈血2 ml至EDTA抗凝管，輕輕混勻，-80℃保存，待統(tǒng)一提取基因組DNA。

基因組DNA的制備 標(biāo)本解凍，提取基因組DNA，步驟如下：(1)在500 μl血液中加入800 μl的TBP Buffer用1 ml的 Tip頭輕輕吹打使其混勻，4000 r/min離心3min，棄上清；(2)重復(fù)上述步驟一次，若血樣仍顯紅色則需再次重復(fù)上述步驟，當(dāng)沉淀為無色或淡紅色后用200 μl TE懸浮即可；(3)在準(zhǔn)備好的200 μl樣品中加入500 μl TBM Buffer，混勻；再加入4 μl Proteinase K，混勻，55.0℃保溫 10～20 min；(4)加入260 μl無水乙醇，混勻，用 1 ml Tip 頭將樣品全部轉(zhuǎn)移到套放于2 ml Collection Tube的UNIQ-10柱中；(5)臺(tái)式離心機(jī)8000 r/min，室溫離心1 min；(6)取下UNIQ-10柱，棄去Collection Tube中的廢液。將柱子放回同一根Collection Tube中，加入500 μl Wash Solution，10 000 r/min，室溫離心2 min；(7)重復(fù)步驟(6)一次；(8)取下柱，棄去的全部廢液。將柱子放回同一根 Collection Tube中，10 000 r/min，室溫離心15s，以除去殘留的 Wash Solutions；(9)將UNIQ-10柱放入新無菌的1.5 ml離心管中，在柱膜中央加入40 μl Elution Buffer，室溫放置2 min；(10)10 000 r/min室溫離心1 min。離心管中的液體即為基因組DNA，-20℃保存。

引物設(shè)計(jì) Fen1基因序列來自GenBank(gi|224589802)。引物采用olige 7.0軟件設(shè)計(jì)，引物序列：(1)上游引物-TCAGGCGAGCTGGCCAAACG，下游引物-GTCGCCGCACGATCTCCTCG；(2)上游引物-GCGGGCTGAGGCAGAGAAGC，下游引物-CCAGCCTTCACCAGGGCAGC，設(shè)計(jì)后由北京華大基因公司合成。

PCR反應(yīng) Fen1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為201 bp，PCR試劑盒購于Promega公司，50 μl PCR反應(yīng)體系及條件見表1。

表1 50 μl PCR反應(yīng)體系及條件

PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定 (1)制備膠，稱取0.3g瓊脂糖凝膠倒入燒瓶，加入30 ml 0.5×TBE緩沖液，配制成濃度為1.0%的凝膠，加熱約3 min；(2)灌膠，將凝膠冷卻至60℃左右，加入0.2 μg/ml EB 1 μl，搖勻后緩慢倒入制膠模具，凝膠厚度為3～5 mm，迅速插入梳子，避免產(chǎn)生氣泡，置常溫下凝固；(3)待凝膠完全凝固后，移去梳子，將凝膠置于電泳槽；(4)加入0.5×TBE緩沖液至電泳槽，液面高出凝膠表面約1 mm；(5)加樣孔中加入5 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及50 bp DNA Ladder Marker對(duì)照；(6)凝膠電泳，電壓80V，電泳30 min；(7)ImageQuant-300凝膠成像系統(tǒng)觀察DNA條帶，拍照。

序列測定 取目的條帶亮、無雜帶的PCR產(chǎn)物和上下游引物送至北京華大基因公司進(jìn)行純化測序。

在測序結(jié)果中尋找突變位點(diǎn) 通過Chromas軟件讀出測序結(jié)果，在基因數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)中與 gi|224589802：61563142～61563342進(jìn)行比較，搜索突變位點(diǎn)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，SLE活動(dòng)指數(shù)2000(SLEDAI 2000)與腎臟組織細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)進(jìn)行相關(guān)分析，基因突變頻率及基因型分布在LN患者、胃癌患者、健康者間的比較采用χ2檢驗(yàn)。

結(jié) 果

30例LN患者中，細(xì)胞凋亡檢測全部陽性，凋亡細(xì)胞呈散在分布(圖1)，LN病理分型與AI、SLEDAI 2000的關(guān)系見表2。相關(guān)性分析顯示，SLEDAI 2000與 AI正相關(guān)，r=0.39，P=0.032(圖 2)。

圖1 LN患者腎臟組織細(xì)胞凋亡檢測圖；A圖箭頭所示凋亡細(xì)胞核為棕褐色；B圖為陰性對(duì)照；C圖為陽性對(duì)照(TUNEL，×200)

表2 狼瘡性腎炎病理類型與AI、SLEDAI關(guān)系

圖2 細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)與系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動(dòng)指數(shù)2000 度評(píng)分(SLEDAI，2000)呈正相關(guān)

目的基因經(jīng)PCR后瓊脂糖凝膠電泳凝膠成像見1～3條帶為LN患者，4、5條帶為胃癌患者，6、7健康(圖3)。擴(kuò)增后的目的基因進(jìn)行測序，并對(duì)測序結(jié)果與基因數(shù)據(jù)庫中人Fen1基因進(jìn)行比較后，LN患者、胃癌、健康者 Fen1基因存在 C/—(+61563189)、A/T(+61563198)、A/—(+61563-204)，G/T(+61563303)、T/C(+61563304)位點(diǎn)突變(基因測序結(jié)果見圖 4～6(A)，Blast結(jié)果見圖4～6(B)，上述各突變位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)分析(P＞0.05)，未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的堿基變異(表3，4)。

圖3 瓣?duì)顑?nèi)切核酸酶1目的基因61563142～61563342片段電泳凝脈成像

圖4 A：狼瘡性腎炎(LN)患者目的基因測序圖譜，B：LN患者目的基因Blast結(jié)果

圖5 A：胃癌患者目的基因測序圖譜；B：胃癌患者目的基因Blast結(jié)果

圖6 A：健康人群目的基因測序圖譜；B：健康人群目的基因Blast結(jié)果

表3 狼瘡性腎炎(LN)組與胃癌組堿基變異統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

表4 狼瘡性腎炎(LN)組與健康組堿基變異統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

討 論

目前應(yīng)用糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑聯(lián)合治療可緩解多數(shù)LN患者病情，但仍有部分患者對(duì)傳統(tǒng)的免疫抑制劑治療無效或效果差。隨著對(duì)LN發(fā)病機(jī)制的深入研究，針對(duì)發(fā)病機(jī)制中某一環(huán)節(jié)或影響發(fā)病及疾病進(jìn)展的關(guān)鍵分子進(jìn)行選擇性靶向治療，已成為LN治療的新方向。細(xì)胞凋亡清除異常，形成自身抗原，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗體，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)紊亂是LN 發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)［6，11，12］，我們對(duì) 30 例 LN患者的腎組織標(biāo)本進(jìn)行凋亡檢測，所有患者腎組織凋亡檢測均陽性，凋亡細(xì)胞散在分布腎小球及腎小管，根據(jù)ISN/RPS 2003制定的病理分型標(biāo)準(zhǔn)，30例LN患者中以Ⅳ型最多(40.00%)，其次Ⅱ型(26.67%)，Ⅲ型 16.67%，Ⅴ型 13.33%，Ⅵ 型3.33%，無Ⅰ型病變患者。回顧分析臨床資料進(jìn)行SLEDAI 2000評(píng)分發(fā)現(xiàn)，SLEDAI與 AI呈正相關(guān)。上述結(jié)果表明LN患者存在細(xì)胞凋亡清除障礙，當(dāng)大量的凋亡小體在腎組織中滯留時(shí)，導(dǎo)致凋亡物質(zhì)“進(jìn)出”平衡失調(diào)，造成凋亡物質(zhì)的累積，未及時(shí)清除的凋亡細(xì)胞質(zhì)膜破裂后釋放出大量的自身內(nèi)容物，包括核小體碎片、DNA、組蛋白成分等凋亡物質(zhì)，引發(fā)炎癥反應(yīng)和自身免疫，成為維持自身免疫應(yīng)答的反復(fù)性的刺激源，不斷攻擊已經(jīng)致敏的免疫系統(tǒng)，破壞其對(duì)自身抗原的中樞和外周耐受，出現(xiàn)組織器官受損，進(jìn)而引發(fā)炎癥和免疫應(yīng)答，促使LN的發(fā)生、發(fā)展［13，14］。本研究發(fā)現(xiàn)，凋亡細(xì)胞的數(shù)量越多，SLE病情越活躍，說明在LN進(jìn)程中，凋亡產(chǎn)物累積越多，造成的腎臟損害越嚴(yán)重，進(jìn)一步證明細(xì)胞凋亡障礙在其疾病進(jìn)展及惡化中的作用。

探尋LN患者細(xì)胞凋亡障礙的機(jī)制，有效地對(duì)其進(jìn)行扳正和修復(fù)，才能獲得LN根本的治療效果，而對(duì)LN凋亡障礙機(jī)制的探討，更多應(yīng)著眼于其分子病因?qū)W的研究。基因組穩(wěn)定性的維持，及DNA的復(fù)制和修復(fù)，都需要一系列的核酸內(nèi)切酶和外切酶的參與，F(xiàn)en1就是其中之一［8］，F(xiàn)en1基因E160D點(diǎn)突變影響Fen1核酸酶功能，致使細(xì)胞凋亡過程中核小體DNA鏈不能有效分解，當(dāng)大量的凋亡小體在機(jī)體組織中滯留時(shí)，作為具有免疫原性的靶抗原，構(gòu)成危險(xiǎn)信號(hào)對(duì)免疫系統(tǒng)造成威脅，誘發(fā)腫瘤、自身免疫性疾病等［7，10］。

目前Fen1基因和人類疾病的研究多見于腫瘤領(lǐng)域［9，10］，在SLE中鮮見報(bào)道。我們曾對(duì)43例 LN患者和26例健康者的外周血標(biāo)本，采用全血基因組DNA柱式試劑盒提取DNA，直接PCR方法擴(kuò)增Fen1基因外顯子包含E160D位點(diǎn)的目的片段，擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物應(yīng)用基因測序方法檢測Fenl基因序列，并對(duì)測序結(jié)果與基因數(shù)據(jù)庫中Fenl基因進(jìn)行比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LN患者正向測序中存在946位堿基C缺失突變(未發(fā)表資料)。

本研究進(jìn)一步收集50例LN患者，25例健康者，20例胃癌患者的外周血標(biāo)本，對(duì)Fen1基因外顯子包含E160D位點(diǎn)的61563142～61563342目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后的目的基因進(jìn)行測序，比較LN患者、胃癌、健康者Fen1基因突變情況。結(jié)果顯示，三組Fen1基因外顯子61563142～61563342目的片段未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的堿基變異，E160D位點(diǎn)未變異，可能原因?yàn)闃颖玖啃?，人群分布存在差異等，但由于試?yàn)樣本量有限，而且未對(duì)Fen1基因全序列進(jìn)行測序，F(xiàn)en1基因在LN發(fā)病及進(jìn)展中的意義還需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步研究。

對(duì)Fen1基因進(jìn)行全序列研究可能對(duì)其在LN發(fā)病機(jī)制中的作用更有價(jià)值，F(xiàn)en1基因異常在LN動(dòng)物模型中的研究也為該基因在LN發(fā)病機(jī)制中的作用提供很大的價(jià)值，我們的進(jìn)一步研究將圍繞LN細(xì)胞凋亡異常，對(duì)大樣本的LN人群進(jìn)行Fen1基因全基因組關(guān)聯(lián)研究，同時(shí)在LN動(dòng)物模型中對(duì)Fen1基因的異常在LN細(xì)胞凋亡過程及疾病發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中的作用做進(jìn)一步探索。

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