凌 帥，劉 詠,*，姚建銘，李 俊

(1.合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009；2.中國科學院合肥物質(zhì)科學研究院，安徽 合肥 230031)

曲酸是一種重要的有機酸，廣泛應用于化妝品[1]、食品加工、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)[2]等領域。特別是在食品加工領域，由于其安全無毒，作為理想的多酚氧化酶抑制劑[3]，最具應用前景。據(jù)統(tǒng)計，曲酸國際市場需求量在500～600t/a，國內(nèi)市場估計在2a內(nèi)需求可達40～50t。國內(nèi)外需求量的增加，勢必給曲酸的研究帶來更大的動力。目前曲酸的生產(chǎn)以微生物的發(fā)酵為主，為了能夠滿足國內(nèi)外的需求，提高發(fā)酵菌種的產(chǎn)酸量將會是研究的重點，很多學者致力于提高曲酸產(chǎn)量的研究已經(jīng)取得了不少成果。例如李鳳玲等[4]采用單因子的紫外誘變對米曲霉NKS-145進行誘變，曲酸產(chǎn)量最高為8g/L；李一婧等[5]采用紫外線對米曲霉2337進行多次的重復誘變，曲酸最終產(chǎn)量最高為18.13g/L?？梢钥闯鰝鹘y(tǒng)的誘變方法不能達到理想的效果。

離子注入技術(shù)是集化學誘變、物理誘變?yōu)橐惑w的綜合誘變方法，可使遺傳物質(zhì)在基因水平或分子水平上發(fā)生改變或缺失，顯著提高生物的變異率，獲得損傷輕、突變率高、突變譜廣、遺傳穩(wěn)定的誘變效果[6-7]。已被廣泛地應用于農(nóng)作物、微生物育種和轉(zhuǎn)基因[8-10]，在微生物育種方面，已經(jīng)應用于枯草桿菌[11]、α-淀粉酶生產(chǎn)菌[12]、檸檬酸[13]生產(chǎn)菌等諸多菌種的誘變，并且均獲得了理想的誘變效果。本實驗以安徽科聚環(huán)保新能源有限公司實驗室原有米曲霉菌株為出發(fā)菌株，以紫外誘變和氮離子注入誘變的復合誘變選育，篩選出產(chǎn)曲酸水平高的菌種。

1 材料與方法

1.1 菌種

滬釀3.042、渝3.811、AS3.866、CICC-2336、CICC-2337共5種米曲霉菌種，由安徽科聚環(huán)保新能源有限公司實驗室提供。

1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法

斜面PDA培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯200、蔗糖20、瓊脂20，pH值自然；30℃恒溫培養(yǎng)72h。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖100、玉米粉20、酵母膏10、KH2PO45、MgSO4·7H2O 2.5，pH值自然；250mL三角瓶裝種子培養(yǎng)基50mL，接一環(huán)菌種孢子于培養(yǎng)基中，30℃恒溫，搖床180r/min培養(yǎng)24h，作為一級種子。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖100、酵母膏2.5、K2HPO41、KCl 0.5、MgSO4·7H2O 0.5，pH值自然；500mL三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基85mL，吸取15mL一級種子液，即接種量為15%，30℃恒溫，搖床180r/min培養(yǎng)7d。

篩選培養(yǎng)基：發(fā)酵培養(yǎng)基+20g/L瓊脂+0.5g/L曲拉通+10g/L FeCl3-HCl顯色劑，pH值自然；30℃恒溫培養(yǎng)72h。

1.3 出發(fā)菌株的篩選

選擇本實驗室現(xiàn)有產(chǎn)曲酸的5個菌種：滬釀3.042、渝3.811、AS3.866、CICC-2336、CICC-2337，利用Fe3+與曲酸絡合反應可生成紅色物質(zhì)的特性，搖瓶發(fā)酵，取發(fā)酵上清液采用三氯化鐵比色法選出曲酸產(chǎn)量最高的菌株，作為實驗的出發(fā)菌株。

1.4 菌種誘變

1.4.1 誘變的流程

1.4.2 孢子懸浮液的制備[14]

取新鮮的斜面菌種，用加入0.5g/L曲拉通的無菌水洗下，經(jīng)過玻璃珠打散，制備成含孢子1×106個/mL懸浮液。放入培養(yǎng)箱中30℃萌發(fā)12h。

1.4.3 UV誘變[15-16]

各取5mL萌發(fā)12h后的米曲霉2336孢子懸浮液于6塊無菌培養(yǎng)皿中，將其中5塊放入帶有磁力攪拌器的暗箱中，15W、30cm振蕩進行紫外照射，分別照射20、40、60、80、100s，未經(jīng)過紫外照射的培養(yǎng)皿作為對照。照射完后將所有培養(yǎng)皿放入黑暗處2h。

1.4.4 亞硝酸鹽誘變

分別取萌發(fā)12h的UV7孢子懸浮液1mL、pH4.5醋酸緩沖液2mL以及0.1mol/L亞硝酸鈉溶液1mL于4支無菌試管中，于25～26℃分別保溫5、10、15、20min，再加入0.07mol/L pH8.6的磷酸氫二鈉溶液20mL終止反應。以加入UV7孢子懸浮液1mL和23mL無菌水的試管為對照。

1.4.5 氮離子注入誘變[17-18]

各取0.1mL萌發(fā)12h后的UV7孢子懸浮液，均勻涂布于6塊無菌培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿置于超凈工作臺上，待無菌風將平板表面的水跡吹干后對其中5塊板進行注入。離子注入機是由中國科學研究院離子束生物工程重點實驗室研究制備的。在注入機上，以10keV的注入能量分別對孢子液進行5×1014、10×1014、15×1014、20×1014、25×1014ions/(cm2·s)不同劑量的注入；注入靶室的真空度為10-3Pa。將以同樣方法涂布吹干后但未經(jīng)過離子注入的樣品作為對照。注入完成后立即在超凈工作臺上用新鮮無菌水洗脫所有培養(yǎng)皿上的孢子。

1.4.6 高產(chǎn)菌株的篩選

初篩：取經(jīng)過誘變處理后的孢子液，適當稀釋后涂布于篩選顯色板上，放入培養(yǎng)箱中30℃黑暗培養(yǎng)，3d后進行觀察，挑選出最先出現(xiàn)紅色與紅色較深的單菌落，保存于斜面培養(yǎng)基上；復篩：取經(jīng)過初篩選出的斜面菌種，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、搖床180r/min發(fā)酵培養(yǎng)7d后，采用三氯化鐵比色法測定發(fā)酵上清液曲酸含量，與對照菌株的曲酸產(chǎn)量相比，進行復篩。

1.5 菌種生長曲線的測定

從發(fā)酵第2天開始，每天取發(fā)酵液100mL，4500r/min離心，上清液采用三氯化鐵比色法測定曲酸含量，菌絲體105℃烘干至質(zhì)量恒定，測定生物量。連續(xù)取樣至發(fā)酵第10天。

1.6 突變菌株傳代實驗

為了確定經(jīng)過復合誘變而得到的高產(chǎn)菌株產(chǎn)酸能力是否穩(wěn)定。對經(jīng)過不同復合誘變得到的菌種進行傳代產(chǎn)酸性能實驗。經(jīng)過一級種子液，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，按照15%接種量，30℃恒溫，搖床180r/min的發(fā)酵條件培養(yǎng)7d后測定發(fā)酵上清液中曲酸含量。每次傳代發(fā)酵都做平行實驗。

1.7 指標測定

曲酸含量的測定：三氯化鐵比色法[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 出發(fā)菌株的篩選

對滬釀3.042、渝3.811、AS3.866、CICC-2336、CICC-2337這5株菌種進行篩選，結(jié)果顯示CICC-2336與Fe3+反應產(chǎn)生的顏色最深，并且采用三氯化鐵比色法測出的曲酸含量也是最高。最終選擇出CICC-2336為實驗出發(fā)菌株，原始產(chǎn)酸量為12g/L，結(jié)果見圖1。

圖 1 出發(fā)菌株選育結(jié)果Fig.1 Screening of starting strain for mutation breeding

2.2 誘變結(jié)果與分析

2.2.1 顯色篩選板

根據(jù)曲酸與Fe3+發(fā)生螯合反應，產(chǎn)生紅色物質(zhì)的原理。由圖2可知，3d后對篩選板上的單菌落進行篩選，挑選出最先出現(xiàn)紅色與紅色較深的單菌落保存于斜面培養(yǎng)基上。

圖 2 培養(yǎng)3d后的顯色板Fig.2 Colony formation after 3 days of culture on chromogenic medium

2.2.2 紫外(UV)誘變存活率及選育結(jié)果

圖 3 UV誘變存活率曲線Fig.3 Survival rate of Aspergillus oryzae CICC-2336 after exposure to UV

由圖3可知，隨著照射時間的增加，菌株的存活率逐漸下降，照射時間為100s時，菌株幾乎無存活，這樣將很難選育到優(yōu)良的菌株。一般采用存活率在20%左右的誘變劑量。因此，最適的誘變劑量為距離15W紫外燈30cm處照射40s，此時的存活率為21.02%。圖4顯示，經(jīng)過搖瓶復篩選育出一株編號UV7的突變菌株，其產(chǎn)酸量為18.50g/L。與原始菌株2336相比產(chǎn)酸量提高54.17%。

圖 4 UV誘變選育結(jié)果Fig.4 Kojic acid production of UV-induced mutant strains

2.2.3 亞硝酸鹽(NV)誘變的存活率及選育結(jié)果

由圖5可知，隨著誘變時間的增加，菌株的存活率逐漸下降，誘變時間為15min時，菌株幾乎已無存活，這樣將很難選育到優(yōu)良的菌株。一般采用存活率在20%左右的誘變劑量。因此，最適的誘變時間為5min，此時的存活率為24.23%。圖6顯示，經(jīng)過搖瓶復篩選育出一株編號NV3的突變菌株，其產(chǎn)酸量為23.58g/L。與原始菌株2336相比產(chǎn)酸量12g/L提高96.50%，與UV7菌株產(chǎn)酸量18.50g/L相比，提高27.46%。

圖 5 亞硝酸鹽誘變存活率曲線Fig.5 Survival rate of Aspergillus oryzae CICC-2336 after nitrite treatment

圖 6 亞硝酸鹽(NV)誘變選育結(jié)果Fig.6 Kojic acid production of nitrite-induced mutant strains

2.2.4 N+注入誘變存活率及選育結(jié)果

圖 7 注入能量為10 keV N+注入存活率曲線Fig.7 Survival rate of Aspergillus oryzae CICC-2336 after N+implantation (10 keV)

圖 8 N+誘變選育結(jié)果Fig.8 Kojic acid production of N+ implantation-induced mutant strains

由圖7可知，隨氮離子注入劑量的增加，菌株存活率曲線呈現(xiàn)較明顯的先降后升再降的“馬鞍型”變化。在注入劑量為5×1014ions/(cm2·s)時，菌株的存活率為

42.12%，當注入劑量為10×1014ions/(cm2·s)時，存活率下降到22.87%，但是注入劑量達到15×1014ions/(cm2·s)時，菌株存活率反而提高到29.12%，接著增大注入劑量到20×1014ions/(cm2·s)時，存活率又降低到12.43%。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的主要原因是低劑量注入時，離子對細胞表面進行損傷和刻蝕，因而存活率較高。隨著劑量的增加，細胞表面刻蝕嚴重，離子損及細胞內(nèi)部并產(chǎn)生大量自由基和軟射線等，致使存活率急劇下降；繼續(xù)加大劑量，細胞某種修復機制和修復酶被激活，存活率又有所回升。本實驗選用10×1014ions/(cm2·s)的注入劑量為誘變的最適劑量，其存活率為22.87%。由圖8篩選結(jié)果可以看出，經(jīng)過7d搖瓶篩選后，獲得1株高產(chǎn)菌株N11，其產(chǎn)酸量為24.12g/L。與UV7菌株產(chǎn)酸量18.50g/L相比，提高30.38%，與NV3相比，產(chǎn)酸量提高2.29%，與原始菌株2336產(chǎn)酸量12g/L相比，更是提高101%。

2.3 菌種的生長曲線

圖 9 米曲霉2336生長曲線Fig.9 Time courses of cell growth and kojic acid production of the parent strain 2336

圖 10 米曲霉N11生長曲線Fig.10 Time courses of cell growth and kojic acid production of the mutant strain N11

由圖9可知，米曲霉2336發(fā)酵產(chǎn)曲酸量第7天達到最大值；生物量在第5天達到最大。所以，米曲霉2336的發(fā)酵周期為7d。圖10可以看出，誘變菌種N11發(fā)酵產(chǎn)酸量也是在第7天達到最大值；生物量在第6天達到最大。所以，米曲霉N11的發(fā)酵周期也為7d。

2.4 突變菌株的遺傳穩(wěn)定性

誘變菌種N11經(jīng)過6次傳代實驗，每次傳代1號瓶與2號瓶兩個平行瓶之間的曲酸產(chǎn)量相差不大，整體產(chǎn)酸量均保持在23.65g/L左右，菌株性能穩(wěn)定，結(jié)果見圖11。而誘變菌種NV3傳代到第2代時，產(chǎn)酸量就由原來的23.58g/L降到了17.45g/L(結(jié)果未顯示)，出現(xiàn)了明顯的下降。經(jīng)過紫外、N+注入復合誘變選育出1株高產(chǎn)菌株N11，該菌株的產(chǎn)酸量達到24.12g/L，比出發(fā)菌株提高101%。比以往的傳統(tǒng)單因素誘變提高顯著，雖然結(jié)果與采用紫外、亞硝酸鹽的復合誘變獲得的菌株NV3相比，產(chǎn)量只提高2.29%，但是經(jīng)過傳代實驗后，NV3在傳代到第2代就出現(xiàn)產(chǎn)量明顯下降的情況，而N11經(jīng)過傳代6次后，產(chǎn)量基本保持在23.65g/L左右，說明采用N+注入這種化學誘變、物理誘變?yōu)橐惑w的綜合誘變方法能夠得到遺傳穩(wěn)定性更好的高產(chǎn)菌株，再加上離子注入誘變除了引起微生物能量沉淀造成機體損傷外，還可以產(chǎn)生動量傳遞和遺傳物質(zhì)原子移位、重排，它本身就相當于一種復合誘變，比單一誘變更有效。因此證明本復合誘變是一種更有效的誘變方法，對提高菌種產(chǎn)酸水平有非常好的效果。

圖 11 米曲霉N11傳代結(jié)果Fig.11 Genetic stability of the mutant strain N11 for kojic acid production

3 結(jié) 論

3.1 從5種可產(chǎn)曲酸的實驗菌株中篩選出1株出發(fā)菌株CICC-2336，并且測定出其原始產(chǎn)酸量為12g/L。

3.2 經(jīng)過N+注入誘變的菌種，發(fā)生了較理想的正突變，隨著氮離子注入劑量的增加，菌株存活率曲線呈現(xiàn)較明顯的先降后升的“馬鞍型”變化。理想的注入條件為：注入能量10keV，注入劑量10×1014ions/(cm2·s)。

3.3 比較CICC-2336進行紫外、N+注入的復合誘變和紫外、亞硝酸鹽的復合誘變的實驗結(jié)果，最終確定紫外、N+注入的復合誘變?yōu)檩^有效的誘變方法；經(jīng)過該復合誘變，菌株的產(chǎn)酸水平提高到24.12g/L，比原始菌株提高101%。

3.4 經(jīng)紫外、N+注入的復合誘變獲得的曲酸高產(chǎn)菌株經(jīng)過6次傳代實驗，產(chǎn)酸量基本維持在23.65g/L左右的水平，菌株性狀穩(wěn)定。

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