張 敏，周 梅，王長遠(yuǎn),3

(1.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京 100037；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163000)

米糠4種蛋白質(zhì)的提取與功能性質(zhì)

張 敏1,2，周 梅2，王長遠(yuǎn)2,3

(1.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京 100037；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163000)

按照Osbron法提取米糠中的清蛋白、球蛋白、醇蛋白、谷蛋白，并對4種蛋白進(jìn)行功能性質(zhì)評價(jià)。結(jié)果表明：米糠中清蛋白、球蛋白、醇蛋白、谷蛋白占米糠蛋白總量依次是56.93%、20.84%、3.167%、19.06%；等電點(diǎn)依次是pH4.0、4.0、5.0、4.6。4種蛋白的功能性質(zhì)對比評價(jià)表明：清蛋白的持水性最大，醇蛋白的乳化性最高，清蛋白在等電點(diǎn)處的起泡性最差。SDS-PAGE凝膠電泳分析表明：清蛋白分子的亞基組成分子質(zhì)量為95.43、76.51、52.85kD；球蛋白的亞基組成分子質(zhì)量為103.12、76.51kD；醇蛋白的亞基組成分子質(zhì)量為14.00kD；谷蛋白的亞基組成分子質(zhì)量為36.29、20.00、14.00kD。

谷物蛋白；提取工藝；功能性質(zhì)；亞基組成

米糠是稻谷加工過程中產(chǎn)生的重要副產(chǎn)品，稻谷碾米時(shí)通常先去掉稻殼得到糙米，糙米再經(jīng)碾白碾去米糠得到精白米。米糠中的蛋白質(zhì)是米糠的主要營養(yǎng)成分，米糠蛋白質(zhì)中必需氨基酸的含量和相互比值也符合人體的需要，米糠蛋白質(zhì)還有一個(gè)最大的優(yōu)點(diǎn)即低過敏性，尤其適合于生長速度快以及胃消化功能尚不完全的嬰兒，其所含豐富的組氨酸、精氨酸和半胱氨酸等也是出生時(shí)體質(zhì)量較輕的嬰兒的必需氨基酸，因此米糠蛋白可作為嬰兒食品的主要蛋白原料[1]。

米糠蛋白具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，其組成主要為清蛋白、球蛋白、谷蛋白及醇溶蛋白，這4種蛋白質(zhì)的質(zhì)量比例為37:36:22:5，其中可溶性蛋白質(zhì)約占70%，與大豆蛋白相近[2]。

盡管米糠蛋白的營養(yǎng)潛力和經(jīng)濟(jì)價(jià)值已經(jīng)被公認(rèn)，但由于米糠含有大量纖維、半纖維和植酸等，它們對蛋白質(zhì)有較強(qiáng)束縛作用，普通溶劑無法使這些蛋白溶解出來；且米糠脂肪含量較高，易氧化酸敗，往往需要先經(jīng)加熱穩(wěn)定化處理，經(jīng)這些處理后更增加蛋白質(zhì)提取難度[3]。

目前，食品級的米糠蛋白產(chǎn)品在國內(nèi)仍然缺乏生產(chǎn)和應(yīng)用。國內(nèi)外對大豆球蛋白、玉米醇蛋白等進(jìn)行了大量的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究，市場前景極為可觀。而對米糠清蛋白、球蛋白、醇蛋白、谷蛋白的研究還比較薄弱。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂米糠(蛋白質(zhì)含量19.06%)：黑龍江省北大荒米業(yè)有限公司。

牛血清白蛋白、丙烯酰胺、N,N-甲叉雙丙烯酰胺、Tris、甘氨酸、考馬斯亮藍(lán)R-250 美國Sigma公司；蛋白質(zhì)Marker 上海潤成生物科技有限公司；其他所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 清蛋白、球蛋白、醇蛋白、谷蛋白提取工藝

采用Osbron法[4-5]提取米糠中的清蛋白、球蛋白、醇蛋白、谷蛋白，實(shí)驗(yàn)工藝流程如圖1所示。

圖 1 Osbron法提取米糠中的清蛋白、球蛋白、醇蛋白、谷蛋白工藝流程Fig.1 Procedure for Osbron extraction of albumin, globulin, gliadin and glutenin from rice bran

1.2.2 蛋白含量的測定

采用凱氏定氮法[6]測定米糠及其清蛋白、球蛋白、醇蛋白、谷蛋白中的蛋白質(zhì)含量。

1.2.3 等電點(diǎn)的確定

采用福林酚法[7-8]，根據(jù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)處蛋白溶解性最低的原理，通過測蛋白質(zhì)的濃度來測定米糠蛋白的等電點(diǎn)。

1.2.4 蛋白功能性質(zhì)測定

1.2.4.1 持水性測定[9]

取5.0g樣品分散于95mL水中，不同溫度條件下攪拌15min后靜置2h，500r/min離心15min，棄去上清液，稱沉淀質(zhì)量，按式(1)計(jì)算持水性。

1.2.4.2 乳化性能測定[10]

用0.2mol/L pH7.0的磷酸緩沖溶液配制1g/100mL的蛋白溶液并用濃度為0.1mol/L的HCl或濃度為0.1mol/L的NaOH分別調(diào)pH值，然后加入大豆油比例為4:1，最高轉(zhuǎn)速10000r/min均質(zhì)1min，之后立即于容器底部取樣100μL，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的SDS溶液稀釋10倍，混勻后于500nm波長處測定吸光度，以SDS溶液作為空白。乳化活性(EAI)按式(2)計(jì)算。

式中：A0為均質(zhì)后迅速被稀釋的乳化液的吸光度；ρ為蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度/(g/mL)；N為稀釋倍數(shù)；Φ為乳化液中油的體積分?jǐn)?shù)(本實(shí)驗(yàn)是0.25)。

1.2.4.3 米糠蛋白起泡性(FA)[11]

取一定量的米糠蛋白樣品，用25mL水溶液制備成一定濃度、pH值、溫度和氯化鈉濃度梯度的蛋白質(zhì)分散系，移入50mL的離心管中，使用電動分散均質(zhì)機(jī)在12000r/min攪拌2min，以產(chǎn)生的氣泡的頂端與液面的距離為高，容器的橫截面積為底面積，立即讀取泡沫體積，按式(3)計(jì)算起泡性。

式中：V0為溶解樣品水溶液的體積/mL；V為攪拌停止時(shí)泡沫的體積/mL。

1.2.5 SDS-PAGE凝膠電泳

采用14%分離膠、4%濃縮膠對清蛋白、球蛋白、醇蛋白、谷蛋白等蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析[12]。先恒流電壓80V，40min后將電壓調(diào)節(jié)到120V。固定液固定30min，R-250染色，染色30min，用脫色液脫色。用Alphalmager HP凝膠成像系統(tǒng)拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種蛋白含量測定結(jié)果

圖 2 米糠Osboren方法提取后各蛋白質(zhì)組分的百分含量Fig.2Contents of albumin, globulin, gliadin and glutenin in total proteins from rice bran

采用Osboren方法提取清蛋白、球蛋白、醇蛋白、谷蛋白，測定各蛋白質(zhì)組分含量，求得各蛋白質(zhì)組分占總提取蛋白質(zhì)含量的百分比，結(jié)果如圖2所示。提取出的米糠蛋白中清蛋白含量最多，占提取蛋白總量的56.93%，球蛋白、谷蛋白次之，分別占20.84%和19.06%，醇溶蛋白含量最少，占3.167%。采用Osboren方法提取米糠中的4種蛋白質(zhì)，大約只能提取11%左右米糠中的蛋白，在殘?jiān)蛷U液中仍殘留約占原料8%左右的蛋白質(zhì)。

2.2 米糠蛋白等電點(diǎn)的確定

采用福林-酚法，根據(jù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)處蛋白溶解性最低的原理，通過測定沉淀離心后上清液的蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度來測定米糠蛋白的等電點(diǎn)，如圖3所示。

圖 3 不同pH值緩沖溶液體系離心沉淀后上清液的蛋白含量Fig.3Effect of buffer solution pH on protein content in the centrifugal supernatants of different rice bran proteins

由圖3可知，4種蛋白在不同pH值緩沖溶液體系中，經(jīng)過沉淀離心后上清液的蛋白含量。清蛋白、球蛋白、醇蛋白、谷蛋白分別在pH 4.0、4.0、5.0、4.6處上清液中的蛋白含量最低，可以說明清蛋白、球蛋白、醇蛋白、谷蛋白的等電點(diǎn)分別是pH 4.0、4.0、5.0、4.6，從圖中也可以間接的反應(yīng)出4種蛋白的在不同pH值緩沖溶液體系中的溶解特性。

清蛋白在pH≥9.0的緩沖溶液體系中，溶解性突然增大，由于清蛋白在pH≥9.0的堿性體系中，清蛋白發(fā)生了可逆變性導(dǎo)致的。谷蛋白在pH≥9.0的堿性體系中，溶解性也有所增加。谷蛋白也發(fā)生了可逆變性而導(dǎo)致的。pH值離蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，水化作用越弱，蛋白質(zhì)分子的分散性越好，溶解度越大，這與其他蛋白性質(zhì)一樣。

2.3 米糠蛋白的持水性

圖 4 溫度對米糠蛋白持水性的影響Fig.4Effect of temperature on the water-binding capacity of rice bran proteins

由圖4可知，溫度20～90℃之間，隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)的吸水性呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。可能是隨著溫度的繼續(xù)升高，氫鍵作用和離子化基團(tuán)結(jié)合水的能力下降，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)合水的能力下降。同時(shí)，也可能蛋白質(zhì)受熱變性導(dǎo)致溶解度降低，從而影響了蛋白質(zhì)結(jié)合水的能力[13]。從圖中還可以看出，清蛋白的持水性最大，其次是谷蛋白，再次是球蛋白和醇蛋白，可能由于清蛋白是水溶性蛋白，其他3種蛋白的溶解度由于受到溶解介質(zhì)的離子強(qiáng)度和溶液pH值的影響，其結(jié)合水的能力發(fā)生變化。

2.4 米糠蛋白的乳化性

圖 5 pH值對米糠蛋白乳化性的影響Fig.5Effect of pH on the emulsibility of rice bran proteins

表面疏水性是影響蛋白乳化性的重要因素，米糠蛋白的疏水基少，使其與油脂的結(jié)合性比較低。由圖5可知，清蛋白、球蛋白、谷蛋白的乳化性在pH4的時(shí)候最低，pH值小于4的時(shí)候，乳化性隨pH值的降低而升高，pH值大于4時(shí)乳化性逐漸升高；醇蛋白的乳化性pH5的時(shí)候最低，pH值小于5的時(shí)候乳化性隨pH值的降低而升高，pH值大于5時(shí)乳化性逐漸升高。在pH10時(shí)乳化性都達(dá)到最大。醇蛋白在不同pH值的條件下乳化性都略高于其他3種蛋白，可能是醇蛋白中疏水性的氨基酸略高的原因[13]。pH4.0～5.0時(shí)蛋白質(zhì)溶解度低，蛋白質(zhì)在油水界面吸附擴(kuò)散受到控制。然而，pH6.0～11.0范圍內(nèi)蛋白質(zhì)溶解度增加，活化能阻礙不讓蛋白遷移發(fā)散。蛋白質(zhì)溶解度的初步增加推動了油相和水相的交互作用。然而，由于溶解度增加，造成蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的進(jìn)一步增加導(dǎo)致了在水相蛋白的積累。pH值高時(shí)溶解度的進(jìn)一步增加導(dǎo)致乳化性不在有明顯的升高甚至?xí)兴档汀?/p>

2.5 米糠蛋白的起泡性

圖 6 pH值對米糠蛋白起泡性的影響Fig.6Effect of pH on the foaming capacity of rice bran proteins

蛋白水解物的起泡方法的測定是在有大量氣體存在時(shí)攪打蛋白溶液，攪打能產(chǎn)生較為激烈的機(jī)械應(yīng)力和剪切作用，使氣體卷入液體形成氣泡并使其分散的更為均勻。較高的溶解性、親水性分子可以提高界面的交互作用，從而影響起泡能力。

由圖6可知，在pH值接近4種蛋白等電點(diǎn)時(shí)，其起泡性差。4種蛋白在堿性環(huán)境下和在酸性條件下的起泡性要好。這是由于蛋白分子在酸性或堿性條件下帶凈正或凈負(fù)電荷，導(dǎo)致分子間靜電斥力增加并削弱了分子的疏水相互作用，分子柔性增大，有利于其更快地吸附至氣液界面從而增強(qiáng)了起泡能力[14]。

2.6 4種米糠蛋白的SDS-PAGE電泳分析

圖 7 米糠蛋白SDS-PAGE電泳圖譜Fig.7SDS-PAGE of protein isolates from rice bran

采用14%分離膠、4%濃縮膠對4種蛋白進(jìn)行SDSPAGE電泳分析，用Alphalmager HP凝膠成像系統(tǒng)拍照得到的電泳圖譜如圖7所示，清蛋白和球蛋白為代謝活性物質(zhì)，是由低分子質(zhì)量的蛋白亞基構(gòu)成，清蛋白的亞基分子質(zhì)量分布大概在95.43、76.51、52.85kD、球蛋白亞基的分子質(zhì)量大概分布在103.12、76.51kD；醇蛋白和谷蛋白是貯藏蛋白質(zhì)，醇蛋白是由一條肽鏈通過分子間的二硫鍵連接而成的，谷蛋白是由多肽鏈彼此通過二硫鍵連接而成的大分子組成[15]。醇蛋白亞基的分子質(zhì)量大概分布在14kD，谷蛋白亞基的分子質(zhì)量大概分布在36.29、20.00、14.00kD。

3 結(jié) 論

3.1 米糠中清蛋白、球蛋白、醇蛋白、谷蛋白占米糠蛋白總量依次是56.93%、20.84%、3.167%、19.06%。

3.2 清蛋白、球蛋白、醇蛋白、谷蛋白的等電點(diǎn)依次是pH4.0、4.0、5.0、4.6。

3.3 米糠蛋白的持水性隨溫度的升高而增加，清蛋白的持水性最大，其次是谷蛋白，再次是球蛋白和醇蛋白。3種蛋白乳化性在等電點(diǎn)處比較低，醇蛋白的乳化性最高。4種蛋白的起泡性在等電點(diǎn)附近最差，清蛋白的起泡性尤其不佳。

3.4 米糠蛋白中清蛋白主要由分子質(zhì)量95.43、76.51、52.85kD的亞基構(gòu)成，球蛋白由分子質(zhì)量103.12、76.51kD亞基構(gòu)成，醇蛋白由分子質(zhì)量14kD亞基構(gòu)成，谷蛋白由分子質(zhì)量36.29、20.00、14.00kD的亞基構(gòu)成。

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Extraction and Functional Properties of Four Proteins from Rice Bran

ZHANG Min1,2，ZHOU Mei2，WANG Chang-yuan2,3
(1. School of Food and Chemical Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100037, China；2. College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China；3. College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163000, China)

Four protein isolates including albumin, globulin, gliadin and glutenin were extracted from rice bran using the Osbron method and their functional properties were evaluated. Albumin, globulin, gliadin and glutenin accounted for 56.93%, 20.84%, 3.167% and 19.06% of total proteins in rice bran, respectively, and their isoelectric points were 4.0, 4.0, 5.0 and 4.6, respectively. Comparative evaluation of functional properties showed that albumin possessed the highest waterbinding capacity but the weakest foaming capacity at the isoelectric point, and glutenin had the highest emulsibility. SDSPAGE suggested that the subunit molecular weights were 95.43, 76.51 kD and 52.85 kD for albumin, 103.12 kD and 76.51 kD for globulin, 14 kD for gliadin, and 36.29, 20.00 kD and 14.00 kD for glutenin, respectively.

rice bran proteins；extraction；functional properties；subunit

TS201.4；TS210.9

A

1002-6630(2013)01-0018-04

2011-12-28

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31101387)；十二五國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD34B00)

張敏(1972ü)，女，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工。E-mail：xzm7777@sina.com