張熾堅，王 強，唐秋實，劉英菊，孫遠明，唐允健，雷紅濤,*

(1.農業(yè)部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室，廣東省食品質量安全重點實驗室，廣東 廣州 510642；2.華南農業(yè)大學理學院，生物材料研究所，廣東 廣州 510642)

近年來，除草劑在我國用量逐漸增加，極大地提高了勞動效率和勞動產量，但部分除草劑在環(huán)境中穩(wěn)定性強，殘留時間久，對生態(tài)環(huán)境和農產品安全產生危害或風險，逐漸引起人們關注[1]。異丙甲草胺(metolachlor)化學名稱為N-2-乙基-6-甲基苯基-N-(1-甲基-2甲氧基乙基)氯乙酰苯胺，是我國目前生產和使用量最大的除草劑品種之一，其殘留可通過食物鏈進入動物體或人體[2]，雖未有現(xiàn)實例子證明其致癌性[3]，但美國環(huán)境保護局將其歸類為潛在致癌性物質。國標GB/T 5009.174—2003《花生、大豆中異丙甲草胺殘留量的測定》規(guī)定異丙甲草胺在花生和大豆中的最高殘留限量為0.5mg/kg，農業(yè)行業(yè)標準NY 775—2004《玉米中烯唑醇、甲草胺、溴苯腈、氰草津、麥草畏、二甲戊樂靈、氟樂靈、克百威、順式氰戊菊酯、噻酚磺隆及異丙甲草胺最大殘留限量》則規(guī)定異丙甲草胺在玉米籽粒中的最高殘留限量為0.1mg/kg。目前，針對異丙甲草胺的分析方法主要有薄層色譜法[4]、高效液相色譜法[5]、氣相色譜法[6]等。薄層色譜法的靈敏度比較低；高效液相色譜法和氣相色譜法靈敏度高、測定準確，是目前測定異丙甲草胺的主要方法，但儀器設備昂貴，對實驗人員專業(yè)技能要求高。

免疫分析法以其靈敏、準確、前處理簡單、高通量等優(yōu)點，越來越多地用于農藥殘留檢測[7]。但是，除草劑作為小分子半抗原物質，不具有免疫原性，需要化學衍生或重頭合成合適的半抗原，然后還需化學偶聯(lián)制備出人工抗原才能免疫動物，除草劑抗體的制備過程較大分子全抗原物質的抗體制備步驟更為繁復，其中半抗原的設計、合成及人工全抗原的制備成為影響除草劑抗體制備、免疫分析方法建立的關鍵。Schlaeppi等[8]采用重頭合成法，經過六步化學反應，獲得苯環(huán)上帶一個羧基的異丙甲草胺半抗原，盡管制備出了抗體，但半抗原合成步驟過于復雜，對生物分析工作者難度較大，不易實施；Feng等[9]亦建立了異丙甲草胺的酶聯(lián)免疫檢測方法，檢測限只有10ng/mL，但沒有進行實際樣品檢測；而國內尚未見關于異丙甲草胺免疫檢測方法的研究報道。

本實驗以異丙甲草胺為對象，使用3-巰基丙酸(3-MPA)為衍生劑，用一步法合成含羧基的異丙甲草胺半抗原(MMPA)，可大大簡化半抗原的制備步驟，隨后將半抗原偶聯(lián)載體蛋白后免疫動物以獲得異丙甲草胺多克隆抗體，進而建立異丙甲草胺間接競爭酶聯(lián)免疫吸附(indirective competitive enzyme-linked immunosorbent assay，icELISA)分析方法，并將該方法應用于環(huán)境水樣品中異丙甲草胺的檢測，以期為異丙甲草胺的快速檢測提供一種新的生物分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

異丙甲草胺(97.7%) 山東濱州農藥廠；牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA) 上海伯奧生物技術有限公司；辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG抗體 武漢博士德生物工程有限公司；二環(huán)已基碳二亞胺(DCC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、3-巰基丙酸(3-MPA)、弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑 美國Sigma公司；其余試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設備

DRX-400/600核磁共振儀 德國Burker公司；UV2550紫外-可見分光光度計 日本島津公司；MK3多功能酶標儀、Wellwash MK2洗板機 美國Thermo公司；96孔聚苯乙烯酶標板 江蘇海門市三和通明玻璃儀器總廠；6K-15高速冷凍離心機 德國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 抗原的合成與鑒定

1.3.1.1 異丙甲草胺半抗原的合成

將170 mg ( 0 . 599 mmol ) 異丙甲草胺、62mg(0.0593mmol)3-MPA、110mg(1.964mmol)KOH依次加入10mL乙醇溶液中，攪拌狀態(tài)下回流4h，過濾、減壓脫溶得到異丙甲草胺半抗原(MMPA)粗品，用8mL 5%的NaHCO3溶液溶解粗品，然后用6mol/L的HCl溶液調pH值至3.0，乙酸乙酯萃取(5mL×3)，合并有機相，冰水洗(20mL×3)，有機相用無水Mg2SO4干燥，最后硅膠層析純化(展開劑為苯-1,4-二氧六環(huán)-冰乙酸(90：10：1，V/V))，得MMPA純品150.3mg，得率為71%。1H-NMR (600MHz，Methanol-d4，TMS)：δ 1.23(d，J=7.8Hz，3H)，1.25(t，J=7.2Hz，3H)，2.20(s，3H)，2.59(t，J=6.6Hz，2H)，2.63(m，2H)，2.79(t，J=7.8Hz，2H)，3.31(s，3H)，3.47(m，1H)，3.66(dd，J1=10.2Hz, J2=6.0Hz，1H)，3.83(s，2H)，4.45(m，1H)，7.16(d，J=7.8Hz，1H)，7.23(d，J=7.2Hz，1H)，7.28(dd，J=7.8Hz，J=7.2Hz，1H)。

圖 1 異丙甲草胺半抗原的合成路線Fig.1 Synthesis of metolachlor hapten MMPA

1.3.1.2 異丙甲草胺人工抗原的制備與鑒定

采用活潑酯法[10]將異丙甲草胺半抗原與BSA偶聯(lián)制備出免疫抗原MMPA-BSA，與OVA偶聯(lián)制備包被抗原MMPA-OVA，產物用0.9%生理鹽水在4℃條件下透析3d以除掉未反應的半抗原，之后紫外光譜法鑒定半抗原與載體蛋白是否有效偶聯(lián)[11]，分裝并于-20℃保存。

1.3.2 異丙甲草胺抗體的制備

選用2kg左右新西蘭大白兔，初次免疫時將500μg免疫原與弗氏完全佐劑等體積乳化后，進行背部多點注射。每隔4周加強免疫一次，加強免疫的乳化劑選擇不完全佐劑。4次免疫后8d取全血，1mL分裝后于－20℃保存。

1.3.3 間接競爭ELISA的建立

用棋盤滴定法確定最佳包被原質量濃度和抗體工作質量濃度[12]，抗原抗體用量少的實驗組合為最佳工作條件，建立間接ELISA檢測方法[13-14]。每孔加入50μL標準質量濃度梯度的異丙甲草胺和優(yōu)化好的一定質量濃度的抗體，采用Origin 7.5軟件的四參數Logistic模型擬合，異丙甲草胺的半抑制濃度定義為50%抑制濃度(IC50)、檢出限(limit of detection，LOD)定義為10%的抑制濃度(IC10)，檢測范圍定義為20%～80%抑制濃度(IC20～IC80)[15]。

1.3.4 特異性評價

以結構類似物的交叉反應率來評價抗體特異性[16]。采用間接競爭ELISA程序在同等條件下依次建立異丙甲草胺結構類似物的ELISA曲線，求出各自的抑制率為50%時的標準品濃度，用IC50表示。計算交叉反應率：

CR/%= [IC50(異丙甲草胺)/IC50(結構類似物)] ×100。

1.3.5 水樣采集、分析和添加回收實驗

水樣采自華南農業(yè)大學鄱陽湖，添加異丙甲草胺質量濃度為20、40、60、80ng/mL，經過濾紙過濾后，用所建立的icELISA方法對水樣中的異丙甲草胺進行測定，計算加標回收率。

2 結果與分析

2.1 異丙甲草胺抗原合成

異丙甲草胺分子質量只有283.8D，本身不具備免疫原性，屬于半抗原物質，不能直接用于動物免疫。對于半抗原物質制備抗體，首先需要將其與載體蛋白連接，制備出人工完全抗原[17]。由于異丙甲草胺分子上沒有合適的活性基團，很難直接與蛋白偶聯(lián)，因此需要通過一定長度的手臂結構進行蛋白與半抗原的連接，以便半抗原更好暴露給免疫細胞識別；為了盡可能保留異丙甲草胺大部分立體特征和電子特性，偶聯(lián)所需的含羧基空間手臂除了從氯原子處衍生外，也可從N-乙氧丁基處衍生。但后者衍生方法會導致側鏈上減少一個強吸電子的氧原子，可能導致半抗原的電荷分布狀態(tài)發(fā)生變化，與異丙甲草胺的電性相似性降低，而且合成路線復雜，故本實驗未采用?本實驗選擇碳鏈較短的廉價3-MPA作為衍生劑，一步反應即可完成，半抗原的合成路線非常簡便，且是母化合物的Cl原子被替換成O原子，Cl和O電負性接近，較好的保持了目標分子原有特征[18-19]。經核磁鑒定表明半抗原合成成功。

將半抗原與BSA共價結合制備免疫原，經紫外掃描鑒定(圖2)，半抗原在波長250～260nm處有較強吸收，BSA在250nm波長處幾乎無吸收，而MMPA-BSA在250nm波長處表現(xiàn)出一定吸收；此外半抗原在230nm波長處有強吸收峰，BSA在210nm波長處左右有強吸收峰，而MMPA-BSA的強吸收峰處于波長210nm～230nm之間，其吸收曲線既不同于BSA也不同于半抗原的吸收曲線，是一種BSA和半抗原的累加吸收特征曲線。因為透析后不存在游離的異丙甲草胺半抗原，所以這種累加的吸收特征為MMPA-BSA偶合物所貢獻出，而非游離異丙甲草胺半抗原和BSA累加貢獻，說明人工抗原MMPA-BSA合成成功[16]。同理推斷包被抗原MMPA-OVA也合成成功(圖3)。

圖 2 MMPA、BSA、BSA-MMPA的紫外吸收曲線Fig.2 UV spectrum of MMPA, BSA, BSA-MMPA

圖 3 MMPA、OVA、MMPA-OVA的紫外吸收曲線Fig.3 UV spectrum of MMPA, OVA, OVA-MMPA

2.2 間接競爭ELSIA法的建立

2.2.1 抗體效價及工作質量濃度

[12]及棋盤滴定法測定抗體效價與工作質量濃度。本次實驗免疫了兩只兔子，其中一只兔的效價很高，達到1/10000，本實驗后續(xù)工作均用此高效價兔血清。棋盤滴定確定包被抗原的工作質量濃度為0.05μg/mL，抗血清稀釋倍數為10000倍。

2.2.2 標準曲線

確定好包被抗原工作質量濃度、抗血清稀釋倍數后，制作異丙甲草胺的標準曲線。其IC50為34.3ng/mL，最低檢測限IC10為6.3ng/mL，檢測范圍(IC20～IC80)為12.3～99.2ng/mL，并且在檢測范圍內，線性方程為y=－0.8079x＋2.0712，R2為0.996。該靈敏度和檢測范圍可以滿足GB/T 5009.174—2003及NY 775—2004對異丙甲草胺最高殘留限量的檢測要求。

2.2.3 特異性評價

抗體特異性用交叉反應率來表示(表1)，交叉反應率越低，抗體特異性越強。抗體分別與S-(-)-異丙甲草胺、丁草胺、丙草胺、乙草胺、異丙草胺、甲磺隆、莠去津進行icELISA檢測。抗體與丁草胺、丙草胺、乙草胺的交叉反應率為0.5%，與異丙草胺、甲磺隆、莠去津等幾乎無交叉反應，特異性很好。

表1 抗體與異丙甲草胺結構類似物的交叉反應率Table 1 Cross-reactivity of metolachlor antibody towards other related compounds

2.2.4 添加回收實驗

在水樣中添加質量濃度為20、40、60、80ng/mL水平下，異丙甲草胺的平均回收率為89.5%～107.9%，相對標準偏差為9.2%～14.5%(表2)，表明該法準確度和精密度都較高。

表2 異丙甲草胺在水樣中的添加回收實驗(n=8)Table 2 Recovery of metolachlor in water samples (n=8)

3 結 論

本實驗采用一步法合成異丙甲草胺半抗原，大大簡化了半抗原的制備方法，成功制備出特異性、靈敏度較好的異丙甲草胺抗體。利用所獲抗體，建立了一種特異性檢測除草劑異丙甲草胺的icELISA方法，將該法用于添加水樣檢測，結果可靠、靈敏、簡便，可用于環(huán)境水樣中異丙甲草胺的分析與檢測。

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