劉金玲,單風平
(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院,沈陽 110866;2.中國醫(yī)科大學免疫教研室,沈陽 110001)
樹突狀細胞(Dendritic cell,DC)是目前所知機體內(nèi)功能最強大的抗原提呈細胞,參與機體多種自身免疫性疾病、免疫缺陷病、腫瘤及炎癥反應病理過程,在機體抗感染免疫及腫瘤免疫應答過程中起著有重要作用[1]。Toll樣受體(Toll like receptors,TLRs)是一種模式識別受體,在細胞活化信號轉導中起重要作用,是聯(lián)系天然免疫與獲得性免疫橋梁。研究表明,TLR4(Tol-l like receptor 4)可直接或間接結合病原體,通過細胞吞噬和內(nèi)化活動,將病原體及其產(chǎn)物清除,還可誘導防御素和NO表達,因此TLR4在天然免疫中起重要作用[2-4]。
腫 瘤壞死因子-a(Tumor Necrosis Factor-a,TNF-a)是一種主要由活化單核巨噬細胞和T淋巴細胞產(chǎn)生多效性細胞因子,主要作用于免疫細胞調(diào)節(jié),可誘導細胞凋亡,炎癥反應及抑制腫瘤和病毒復制,在疾病感染過程中有重要監(jiān)測意義[5-6]。蛋氨酸腦啡肽(Methionine Enkephalin,MENK)聯(lián)系神經(jīng)、免疫兩大系統(tǒng),是重要細胞因子,具有獨特生物學活性,機體免疫細胞表面廣泛存在其受體[7-8],MENK通過與受體相互作用增強天然免疫系統(tǒng)細胞如自然殺傷細胞、單核細胞、巨噬細胞和獲得性免疫系統(tǒng)細胞如T細胞活性,促進細胞因子釋放等,從而起到免疫調(diào)節(jié)作用[9]。
關于MENK對樹突狀細胞功能研究,國內(nèi)外鮮有報道,本試驗通過體外誘導培養(yǎng)骨髓來源樹突狀細胞,觀察蛋氨酸腦啡肽對GM-CSF誘導的骨髓來源樹突細胞表達TLR-4和TNF-α影響,探明TLR4和促炎癥因子TNF-α表達變化情況,從而探討蛋氨酸腦啡肽對樹突狀細胞免疫功能作用調(diào)節(jié)機制,為臨床研究提供試驗基礎。
6~8周C57BL/6小鼠(購自上海實驗動物研究所);RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含L-谷氨酰胺)、胎牛血清(購自Hyclone公司);熒光素標記的小鼠單抗:CD11c-FITC(購自Biolegend公司);重組小鼠GM-CSF(rmGM-CSF),IL-4(購 自 Biolegend 公司);分裝后于-20℃保存?zhèn)溆?;蛋氨酸腦啡肽(MENK)由中國醫(yī)科大學免疫學教研室提供;RT-PCR Kit、TRIzol、瓊脂糖(購自TaKaRa公司);兔抗鼠TNF-α,兔抗鼠TLR-4多克隆抗體、SABC、DAB顯色試劑盒(購自武漢博士德公司);二抗IgG-HRP(購自美國Santa Cruz公司)。
1.2.1 細胞培養(yǎng)
將7~8周齡的正常C57BL/6鼠頸椎脫位處死,無菌條件下取完整股骨、脛骨,用RPMI-1640培養(yǎng)液將骨髓細胞沖出,收集骨髓細胞懸液經(jīng)離心,紅細胞裂解再次離心后將細胞用RPIM1640培養(yǎng)基懸浮,分裝6孔培養(yǎng)板,每孔106個·mL-1。每孔中別加入不同誘導劑置于含5%CO2,飽和濕度,37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔天半量換液,并用倒置顯微鏡觀察不同時間點樹突狀細胞形態(tài)變化。
1.2.2 試驗分組
在培養(yǎng)的過程中,將細胞分為如下各組,施以不同的刺激條件。①RPMI-1640空白對照組;② GM-CSF(10 ng·mL-1)、 IL-4(5 ng·mL-1)和MENK (10~12 mol·L-1)共刺激組(MENK+G+I);③ GM-CSF(10 ng·mL-1)和 IL-4(5 ng·mL-1)組(G+I)。培養(yǎng)至第7天,用吸管輕輕吹打后收集所有懸浮細胞,經(jīng)流式細胞儀鑒定BM-DCs的純度。
1.2.3 RT-PCR法檢測樹突狀細胞TLR-4和TNF-αmRNA的表達
利用Primer Premier 5.0軟件設計PCR引物,引物均由TaKaRa公司合成,PCR引物見表1。
1.2.3.1 細胞總RNA的提取
各組細胞加入TRIzol裂解液,轉移到1.5 mL離心管中,加入0.2 mL氯仿,離心,吸取上層水相,加等量的異丙醇沉淀RNA,離心,緩慢加人750 μL乙醇洗滌,離心,空氣風干后加入DEPC水溶解。紫外分光光度計測定波長260及280 nm RNA A值,計算RNA的濃度和純度,取0.5 μg RNA用于RT-PCR。
1.2.3.2 cDNA合成
20 μL 體系中含,10×RT Buffer 2 μL,MgCl2(25 mmol·L-1) 4 μL,RNase Inhibitor(40 U·μL-1)0.5 μL,dNTP Mixture(10 mmol·L-1)1 μL,Oligo(dT)-Adaptor Primer 1 μL(2.5 pmol·μL-1), RNase Free dH2O 6.5 μL,總RNA樣本1 μL,AMV Reverse Transcriptase 1 μL(5 U·μL-1)。反應條件:30 ℃ 10 min,65℃ 50 min,95℃ 5 min,5℃ 5 min。
表1 PCR引物Table 1 PCR primer
1.2.3.3 半定量RT-PCR
在 25 μL 體系中含 RNase Free dH2O 12.5 μL,5×PCR Buffer 5 μL,TNF-α,TLR-4及β-actin的上下游引物各 0.5 μL,cDNA 5 μL,Taq酶 0.5 μL,dNTP Mixture(10 mmol·L-1)1 μL。循環(huán)參數(shù)為94 ℃預變性2 min,94℃變性30 s,退火溫度30 s,72℃延伸30 s,30個循環(huán),72℃延伸10 min 4℃保存。
各組取10 μL PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,在Gelpro32凝膠成像系統(tǒng)上進行分析,以各組目的基因條帶和相應β-actin條帶光密度的比值作為相應基因mRNA的相對定量表達水平。
1.2.4 ELISA法檢測樹突狀TNF-α蛋白的表達
每組做4個復孔。各組處理結束后收集培養(yǎng)液于酶標板,37℃孵育2 h,PBS清洗2次,加鼠源TNF-α抗體 100 μL·孔-1,37 ℃孵育 2 h,洗板 3次,加抗鼠HRP-IgG 100 μL·孔-1,37 ℃孵育1 h,洗板,分別加顯色液A和B各50 μL·孔-1,37℃孵育 15 min,加終止液 100 μL·孔-1。酶標儀在450 nm波長處檢測各孔吸光度。
1.2.5 Western-Blot檢測TLR-4蛋白的表達
收集各組培養(yǎng)的成熟的BM-DC,加入2×SDS裂解后,取50 μg蛋白質(zhì)樣品加入到樣品孔中進行SDS聚丙烯酸胺凝膠電泳,然后根據(jù)凝膠面積按300 mA接通電流進行轉膜、封閉、兔抗鼠TLR-4一抗孵育過夜,兔抗鼠IgG-HRP抗體(1∶2 000稀釋),孵育2 h,最后用DAB顯色劑進行顯色。
1.2.6 統(tǒng)計學處理
用SPSS(17.0)統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理,數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示,組間比較采用單因素方差分析,P<0.05表示具有顯著性差異。
取各誘導組細胞懸液0.1 mL至流式管中,加入熒光標記的CD11c-FITC,混勻,4℃避光染色,洗滌后上機檢測,結果顯示MENK+G+I組樹突狀細胞的純度為95.09%,高于G+I組(90.89%),而1640對照組的純度只有9.08%。表明MENK在體外能夠增加骨髓來源樹突狀細胞的誘導純度(見圖1)。
圖1 各組樹突狀細胞純度流式分析Fig.1 Purity analysis of DCs by FCM
RT-PCR結果表明經(jīng)MENK與GM-CSF和IL-4(MENK+G+I)協(xié)同誘導骨髓來源樹突狀細胞TNF-α和TLR-4 mRNA的表達均增多,其中TLR-4 mRNA豐度值與1640對照組相比具有極顯著性差異(P<0.01),與GM-SCF和IL-4(G+I)誘導組相比差異顯著,具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而TNF-αmRNA豐度值(大于1640對照組,差異極顯著(P<0.01),與G+I組相比差異顯著(P<0.05)。上述數(shù)據(jù)表明MENK可以從基因水平上調(diào)樹突狀細胞TNF-α和TLR-4的表達(見圖2、3)。
圖2 各組骨髓來源樹突狀細胞TNF-α和TLR-4 mRNA表達的RT-PCR結果Fig.2 RT-PCR analysis at mRNA levels of of TNF-α and TLR-4 for BM-DCs
圖3 各組骨髓來源樹突狀細胞TNF-α和TLR-4 mRNA表達的RT-PCR結果Fig.3 Analysis of histogram at abundance of TNF-α and TLR-4 for BM-DCs
結果表明,與RPMI1640對照組相比,MENK+G+I組中TNF-α水平有極顯著提高(P<0.01);與G+I組相比差異顯著(P<0.05),數(shù)據(jù)表明,MENK可上調(diào)的細胞因子TNF-α,MENK-12定向誘導Th1型細胞反應(見表2)。
表2 MENK對G+I誘導骨髓來源樹突裝細胞TNF-α表達的影響Table 2 Effect of MENK on TNF-α of BM-DCs induced by GM-CSF and IL-4
收集不同誘導條件下培養(yǎng)的成熟的BM-DCs,提取蛋白質(zhì)后,采用Western-Blot方法從蛋白水平檢測BM-DCs TLR-4的表達情況。結果表明,MENK+G+I組誘導培養(yǎng)的BM-DCs其TLR-4蛋白的表達豐度明顯高于RPIM-1640對照組,差異極顯著(P<0.01),高于G+I組,差異顯著(P<0.05),提示MENK可上調(diào)BM-DCs TLR-4蛋白的表達(見圖4)。
圖4 體外誘導骨髓來源樹突狀細胞TLR-4的表達Fig.4 Expression of TLR-4 of BM-DCs in vitro
DC是免疫應答啟動因子和調(diào)節(jié)因子,是T、B細胞有效刺激因子。近年來,DC在機體免疫系統(tǒng)中重要作用顯現(xiàn),在移植排斥反應、腫瘤免疫治療、感染性疾病和自身免疫性疾病等的診治方面均有研究報道,同時對DC生物學特性、與某些疾病發(fā)生、預后等關系也有進一步深入研究[10-11]。成熟DC表達高水平的主要組織相容性復合體(MHC)分子,并能分泌白細胞介素-l(IL-1)、白細胞介素-6(IL-6)、干擾素-a(IFN-α)、腫瘤壞死因子a(TNF-a)等細胞因子[12],其中TNF-α是TNF家族重要成員之一,是具有廣泛生物學活性的細胞因子,能誘導炎癥因子產(chǎn)生導致細胞凋亡[13]。
Toll樣受體是一種模式識別受體,廣泛分布在免疫細胞表面,在細胞活化信號的轉導中起重要作用,是聯(lián)系天然免疫與獲得性免疫的橋梁,能特異性地識別病原體相關分子模式,激發(fā)動物天然免疫和獲得性免疫的早期免疫反應,這種特性使Toll樣受體成為誘導有效免疫反應對抗病原或自身異常重要候選基因,而Toll樣受體4(TLR-4)是機體對革蘭氏陰性菌表達的脂多糖應答的主要受體,TLR-4活化后,激活NF-κB等轉錄因子,可引起TNF-α、NO等多種炎癥介質(zhì)和細胞因子的表達和釋放[14],并激活獲得性免疫,在炎癥反應中發(fā)揮重要作用。
MENK是一類聯(lián)系神經(jīng)、免疫兩大系統(tǒng),通過作用到免疫細胞阿片受體上發(fā)揮生物學活性細胞因子。Burger等證實MENK具有增強NK細胞活性、刺激的T細胞增殖、顯著增強CTL細胞活性[15]、刺激大鼠腹腔巨噬細胞H2O2和NO產(chǎn)生,協(xié)助巨噬細胞殺菌和抗腫瘤、調(diào)控IL-2、IL-1、IL-4和IFN-γ等細胞因子分泌及抑制細胞生長功能。MENK對免疫系統(tǒng)的調(diào)控功能已被大量體外、體內(nèi)試驗所證實[16]。
本試驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)MENK刺激后,骨髓來源樹突狀細胞純度為95.09%,高于1640對照組和G+I組,而且TLR-4和TNF-α表達在基因水平和蛋白水平均顯著增加,與其他試驗組相比差異顯著,具有統(tǒng)計學意義。TNF-α處于炎癥級反應中心環(huán)節(jié),是TLR4/NF-κB信號通路中下游信號,TNF-α表達量多少是MENK發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用進而干預腫瘤、病毒發(fā)生、發(fā)展的靶分子之一。
本試驗結果提示,在MENK誘導作用下BM-DC增加阿片受體表達,從而上調(diào)TLR-4表達。這一現(xiàn)象與活化后DCs在亞群、表型和細胞因子分泌模式等方面差異性有關,但其確切機理尚待進一步闡明。綜上,樹突細胞表面的阿片受體是介導小鼠DCs活化的重要模式識別受體,間接通過上調(diào)TLR-4表達從而激活NF-κb信號通路,上調(diào)Th1型細胞因子TNF-α等表達,誘導Th1細胞反應,進一步深入探討MENK對樹突狀細胞免疫功能調(diào)控影響,為揭示MENK抗疾病作用機制提供試驗依據(jù)。
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