劉勝旺，張 玥，劉曉麗，李云霞，韓宗璽，邵昱昊，孔憲剛

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所禽病研究室，哈爾濱 150001）

2010年初，在我國南方集中養(yǎng)鴨地區(qū)出現(xiàn)一種引起蛋鴨產(chǎn)蛋量下降的疾病。該病迅速傳播，在國內(nèi)其他養(yǎng)鴨地區(qū)鴨場相繼出現(xiàn)，涉及福建、浙江、廣西、廣東、江蘇、江西、安徽、河南、河北、北京、山東等地。該病導(dǎo)致鴨、蛋鴨產(chǎn)蛋量大幅度下降，肉鴨、育成鴨發(fā)生神經(jīng)癥狀，給我國養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。經(jīng)研究確定該病是由一種新的黃病毒感染引起。這種新的黃病毒隸屬于黃病毒科、黃病毒屬、蚊媒病毒的恩塔亞病毒群，和坦布蘇病毒親緣關(guān)系最近，確定為一種新型鴨黃病毒-鴨坦布蘇病毒（Duck Tembusu virus，DTMUV）[1-8]。2011年中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會第一屆水禽疫病防控研討會將該病名稱統(tǒng)一為“鴨坦布蘇病毒病”。

鴨坦布蘇病毒（DTMUV）的病毒粒子呈球形，45～50 nm之間，有囊膜，表面有纖突[3,5,7]?；蚪M為單股正鏈RNA，含有一個(gè)開放閱讀框，編碼順序?yàn)?'UTR-C-PrM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-UTR3'。其中有3種結(jié)構(gòu)蛋白C、PrM、E和7種非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5。

本研究對病料進(jìn)行病毒分離，全基因測序。國際上通常以黃病毒NS5基因3'端長約1 kb的區(qū)域同源性作為黃病毒屬病毒分類依據(jù)。通過對實(shí)驗(yàn)室分離株Du/CH/LSD/110128株全基因和NS5基因?qū)Ρ确治觯_定該株病毒屬于新型鴨坦布蘇病毒（DTMUV）。

1 材料與方法

1.1 病料來源主要材料

病料來自山東某發(fā)病鴨場；RNAiso Plus、One Step RT-PCR Kit Ver.2、pMD18-T載體、250 bp DNA Ladder Marker以及3'RACE快速擴(kuò)增試劑盒等（購自寶生物工程（大連）有限公司）；DNA回收試劑盒（購自O(shè)MEGA公司）；0.22 μmol·L-1一次性濾器（購自Millipore公司）；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純；大腸埃希氏工程菌JM109由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 動物

SPF鴨胚購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.3 病毒分離

對來自山東某發(fā)病鴨場病料進(jìn)行研磨，加入PBS勻漿，-70℃反復(fù)凍融3次，8 000 r·min-1離心5 min，吸取上清液，用 0.22 μmol·L-1一次性濾器過濾除菌后將濾液裝于凍存管中備用。將濾液以0.1 mL·胚-1，接種于9～11日齡SPF鴨胚，37℃孵育，棄掉24 h以內(nèi)死亡胚，72 h后將接種鴨胚放入4℃，1 h后無菌收取尿囊液。

1.4 全基因序列測定分析

1.4.1 引物的設(shè)計(jì)合成

根據(jù)GenBank中登錄的鴨黃病毒BYD-1株（登錄號：JF312912）的序列[2,7]，及參考文獻(xiàn)[15]設(shè)計(jì)10對包含10條互相重疊片段的引物（見表1），由北京六合華大基因科技股份有限公司構(gòu)建。

表1 擴(kuò)增引物Table 1 Primers for PCR in amplification

1.4.2 病毒RNA的提取

對收取的尿囊液進(jìn)行病毒RNA提取，取200 μL鴨胚尿囊液，按RNAiso說明書提取RNA，最后用30 μL DEPC水溶解沉淀。通過RT-PCR方法判定病毒分離是否成功。引物使用鴨黃病毒（Flavivirus）的特異性引物，DFLA-F:AGACTGCTG GTGCAATGAGAC和DFLA-R:CGTCGTTCCCAGAT TCCA[1]。預(yù)期擴(kuò)增片段長度250 bp，RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4.3 病毒全基因組克隆

將經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測陽性病毒RNA使用已設(shè)計(jì)的10對引物進(jìn)行RT-PCR，產(chǎn)物根據(jù)OMEGA公司膠回收試劑盒說明書回收目的片段。使用常規(guī)方法重組質(zhì)粒，篩選出陽性質(zhì)粒送北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行序列測定。

1.4.4 基因組序列分析

將測得序列通過DNASTAR、BioEdit等軟件進(jìn)行拼接分析，所得序列在GenBank中進(jìn)行BLAST同源序列比對，用MEGA5軟件采用鄰近法分別對Du/CH/LSD/110128株與其他黃病毒科病毒進(jìn)行全基因發(fā)育進(jìn)化樹和NS5基因發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建。并用MegAlign對全基因組和NS5基因進(jìn)行同源性比對。從GenBank下載參考序列的毒株（見表2）,從GenBank下載NS5基因參考序列的毒株（見表3）。

表2 從GenBank下載參考序列的毒株及其縮寫Table 2 Reference viruses in GenBank and their abbreviation

表3 從GenBank下載參考序列的毒株及其縮寫（NS5）Table 3 Reference viruses in GenBank and their abbreviation(NS5)

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離

尿囊腔接種后72 h的胚體有明顯出血點(diǎn)，頸背部出血點(diǎn)明顯（見圖1），對收獲的鴨胚尿囊液提取RNA經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測在250 bp處有明顯條帶。

圖1 鴨胚出血（頸背部出血點(diǎn)）Fig.1 Duck embryo bleeding(neck and back with petechia)

2.2 全基因組擴(kuò)增結(jié)果

將分離到的病毒使用上述10對引物通過RT-PCR擴(kuò)增得到10條相互重疊的片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測，片段大小與預(yù)測基本相符（見圖2）。

圖2 全基因組擴(kuò)增Fig.2 Whole genome amplification

2.3 全基因片段分析

本試驗(yàn)測得的Du/CH/LSD/110128株基因含有一個(gè)開放閱讀框，編碼3 426個(gè)氨基酸組成的多聚蛋白，其中3種結(jié)構(gòu)蛋白（C、PrM、E）和7種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5），與已知的坦布蘇病毒屬病毒基因相似。各個(gè)蛋白在基因中的位置組成（見表4），參照已發(fā)表文獻(xiàn)中已知序列多聚蛋白的切割方法[9-11]，經(jīng)比較可得出各個(gè)蛋白的切割位點(diǎn)基本保守。

表4 Du/CH/LSD/110128全基因組結(jié)構(gòu)Table 4 Full-length genome organization of Du/CH/LSD/110128

2.3 全基因系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果

將本試驗(yàn)分離到的Du/CH/LSD/110128株全基因序列與其他23株黃病毒科病毒進(jìn)行基因核苷酸同源性比對，比對結(jié)果（見表5），并采用鄰近法對它們進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹的構(gòu)建（見圖3）。

2.4 NS5基因分析

對試驗(yàn)分離株Du/CH/LSD/110128與GenBank上已公布的其他32株病毒的NS5基因進(jìn)行核苷酸序列同源性比對。

結(jié)果見表6和圖4。

表5 Du/CH/LSD/110128（NS5）與其他GenBank已公布序列核苷酸同源性比較Table 5 Comparison of Du/CH/LSD/110128(NS5)with reference viruses in GenBank for nucleotide

圖3 鴨坦布蘇病毒DU/CH/LSD/110128株系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of DTMUV DU/CH/LSD/110128 strain

表6 Du/CH/LSD/110128株與其他GenBank已公布序列核苷酸同源性比較Table 6 Comparison of Du/CH/LSD/110128 with reference viruses in GenBank for nucleotide

圖4 鴨坦布蘇病毒Du/CH/LSD/110128株NS5基因系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of DTMUV Du/CH/LSD/110128 strain NS5 gene

3 討論與結(jié)論

鴨黃病毒病最早于1995年出現(xiàn)在河北省石家莊、邯鄲等地，首次鑒定該病的病原為黃病毒科的鴨病毒性腦炎病毒，國外未見報(bào)道[11]。2010年初開始，在我國大部分集中養(yǎng)鴨地區(qū)爆發(fā)。該病迅速傳播，患病鴨多出現(xiàn)腳麻痹、頭頸歪斜等運(yùn)動機(jī)能失調(diào)等神經(jīng)癥狀，產(chǎn)蛋量急劇下降，表現(xiàn)為出血性卵巢炎癥狀[1-8]，臨床易與禽流感新城疫混淆，建立靈敏準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室診斷該病的方法非常重要，顏丕熙等建立的套式RT-PCR方法，靈敏度比常規(guī)PCR高10倍，臨床樣品陽性檢出率高于病毒分離率[14]。Yan等建立了TaqMan探針熒光定量PCR方法，靈敏度是常規(guī)PCR的100倍[16]。截至目前尚沒有可有效防治DTMUV的商品化疫苗研制成功，感染DTMUV后病鴨產(chǎn)生的抗體效價(jià)較低[3,7-8]，雞亦可對DTMUV產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)[12]。篩選出抗原性良好的天然疫苗株對進(jìn)一步研究開發(fā)效果確實(shí)的滅活苗和弱毒苗有至關(guān)重要作用。

對黃病毒的分類，國際上公認(rèn)分類方法是病毒NS5基因核苷酸同源性在84%以上的分離株為同一個(gè)種病毒[13]。本試驗(yàn)對病料進(jìn)行病毒分離檢測和全基因組序列測定分析，確定Du/CH/LSD/110128株病毒含有一個(gè)開放閱讀框，編碼一個(gè)由3 426個(gè)氨基酸組成的多聚蛋白，主要包含3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，其中有一個(gè)囊膜蛋白E和一個(gè)與RNA相連的核心蛋白C，以及一個(gè)較大的前體蛋白PrM。緊接著是非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，為一種糖蛋白，以及NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B 和 NS5[17]。通過對試驗(yàn)分離株Du/CH/LSD/110128與GenBank已公布的一些黃病毒科病毒的基因序列進(jìn)行核苷酸同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)分離株Du/CH/LSD/110128與黃熱病毒（Yellow fever virus）、登革熱病毒（Dengue virus）、伊利烏斯腦炎病毒（Ilheus virus）、西尼羅病毒（West Nile virus）、巴格扎病毒（Bagaza virus）和坦布蘇病毒（Tembusu virus）具有遺傳進(jìn)化關(guān)系。其中與黃熱病毒（Yellow fever virus）親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，與巴格扎病毒（Bagaza virus）親緣關(guān)系較近但遺傳距離介于病毒種的水平上。與其他株坦布蘇病毒親緣關(guān)系最近，全基因組核苷酸同源性和NS5基因核苷酸同源性均在87%以上，可以確定試驗(yàn)分離株Du/CH/LSD/110128屬于黃病毒科、黃病毒屬、蚊媒病毒恩塔亞病毒群的坦布蘇病毒。

黃病毒可引起人類和動物嚴(yán)重疾病，禽源司提阿萬病毒（Sitiawan virus）只對家禽致病不變。傳統(tǒng)坦布蘇病毒被庫蚊這種傳播途徑所隔離，但新型的鴨坦布蘇病毒可對各種鴨致病，其中包括北京鴨、櫻桃谷鴨、紹興鴨[10]。李澤君研究表明該病可以通過直接接觸傳播和空氣傳播[13]，這與其他坦布蘇病毒存在區(qū)別。鴨坦布蘇病毒對鳥類和人類的致病性尚不清楚，其生理和生態(tài)動力學(xué)包括病毒周期也不甚了解。還需要更深入研究以揭示鴨坦布蘇病毒本質(zhì)、生理生態(tài)學(xué)及致病性等。

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