殷秀杰，崔國(guó)文，胡國(guó)富，李景欣，洪銳民，王明君

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

近紅外光譜分析技術(shù)（Near Infrared Reflectance Spectroscopy，NIRS）是一種利用有機(jī)化學(xué)物質(zhì)在近紅外譜區(qū)內(nèi)的光學(xué)特性快速測(cè)定物質(zhì)化學(xué)組分含量的現(xiàn)代光譜技術(shù)。NIRS具有快速、準(zhǔn)確、無(wú)破壞性、可同時(shí)測(cè)定多種成分等優(yōu)點(diǎn)，到目前，NIRS應(yīng)用領(lǐng)域廣泛，其相關(guān)研究也有大量資料報(bào)道[1-9]。

小葉章（Deyeuxia angustifoliaL.）主要分布在我國(guó)東北、華北、內(nèi)蒙古等地區(qū)低濕地，尤以三江平原分布最為集中，是三江平原典型草甸、沼澤化草甸建群植物，它高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、再生能力強(qiáng)、耐踐踏、既可青貯、更易于調(diào)制干草，對(duì)于各種家畜均具有較高適口性。

在生產(chǎn)實(shí)踐中，及時(shí)測(cè)定小葉章?tīng)I(yíng)養(yǎng)價(jià)值對(duì)于指導(dǎo)放牧家畜飼養(yǎng)與營(yíng)養(yǎng)搭配具有重要意義，本文運(yùn)用近紅外漫反射技術(shù)快速測(cè)定小葉章?tīng)I(yíng)養(yǎng)成分中粗蛋白（Crude protein，CP）、粗脂肪（Ether ex?tract，EE）中性洗滌纖維（Neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗滌纖維（Acid detergent fiber，ADF）的含量進(jìn)行探討。

1 材料和方法

1.1 樣品制備

在黑龍江省寶清縣三江平原小葉章草場(chǎng)，于2010年6～8月，每月中旬采集小葉章全株樣品80份，共計(jì)240份。符合Windham所提最低樣品數(shù)為50個(gè)要求[10]。樣品經(jīng)晾曬風(fēng)干，用鋼磨粉碎過(guò)0.25 mm（60目）篩，其用低密度的聚乙烯包裝袋密封好作為待測(cè)樣品。

1.2 樣品測(cè)定

1.2.1 樣品的常規(guī)分析

小葉章樣品CP含量采用凱氏定氮法測(cè)定（AOAC），EE含量采用浸提法測(cè)定，ADF和NDF含量測(cè)定按Van Soest方法進(jìn)行[11]。

1.2.2 樣品光譜的采集

選用由美國(guó)Thermo Nicolet公司生產(chǎn)的AN?TARISⅡ型傅立葉變換近紅外分析儀，儀器工作參數(shù)為：光譜采集范圍4 000～10 000 cm-1；掃描次數(shù)64次；分辨率8 cm-1；數(shù)據(jù)形式：log（1/R）。

每次開(kāi)機(jī)掃描光譜前，儀器預(yù)熱60 min，首先進(jìn)行背景光譜掃描，盡可能消除背景對(duì)光譜干擾。采用旋轉(zhuǎn)樣品臺(tái)以增加采樣面積，樣品杯為5 cm內(nèi)徑，旋轉(zhuǎn)后實(shí)際采集光譜樣品面積為18.84 cm2。測(cè)定時(shí)樣品杯自動(dòng)旋轉(zhuǎn)，以獲得較多樣品的近紅外光譜信息。積分球直徑為10 cm，大體積積分球可以對(duì)樣品漫反射譜進(jìn)行平均，以得到好的光譜重現(xiàn)性。旋轉(zhuǎn)樣品杯中的樣品高度、緊實(shí)度、均勻度盡量做到一致，樣品深度不得低于2 mm。每個(gè)樣品重復(fù)掃描6次，計(jì)算其平均光譜，樣品的近紅外漫反射光譜見(jiàn)圖1。

圖1 小葉章?tīng)I(yíng)養(yǎng)價(jià)值的近紅外光譜Fig.1 Near infrared spectrometer picture of the Nutrition value in Deyeuxia angustifolia.

1.2.3 建立NIRS數(shù)學(xué)模型的方法

在將樣品按某個(gè)指標(biāo)含量大小順序排列后，以3∶1比例將全部樣品劃分成建模樣品集和檢驗(yàn)樣品集（建模樣品180份，檢驗(yàn)樣品60份）。先用校正樣品集建立預(yù)測(cè)模型，根據(jù)R2和SD/RMSEP等指標(biāo)對(duì)模型進(jìn)行優(yōu)化，并最終確定模型。最后用驗(yàn)證集樣品對(duì)模型進(jìn)行外部驗(yàn)證，采用TQ Analyst（6.2）光譜定量分析軟件對(duì)模型再進(jìn)行操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 小葉章樣品營(yíng)養(yǎng)成分的化學(xué)分析結(jié)果

表1是240個(gè)小葉章樣品中各營(yíng)養(yǎng)成分常規(guī)分析結(jié)果。

表1 樣品的營(yíng)養(yǎng)含量Table 1 Nutrition contents of the samples (%)

從表1可以看出各營(yíng)養(yǎng)成分含量的變幅比較大，其含量范圍基本上可以覆蓋小葉章的常態(tài)含量分布，可用于建立小葉章樣品營(yíng)養(yǎng)成分含量的近紅外校正模型。

2.2 小葉章CP、EE、NDF和ADF模型的建立與優(yōu)化

試驗(yàn)采用偏最小二乘回歸（PLS）方法建立定標(biāo)模型，在使用傳統(tǒng)線性回歸模型之前，先對(duì)所需合適變量數(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè)并去除噪音干擾。利用TQ Analyst 6.2分析軟件通過(guò)多元信號(hào)修正（MSC）消除由于樣品大小、均勻性等對(duì)光程的干擾。采用Nor?ris Derivative和Savitzky Golay濾波方法對(duì)光譜進(jìn)行平滑處理，然后采用一階導(dǎo)數(shù)和二階導(dǎo)數(shù)凈化光譜圖，選擇譜區(qū)范圍，并確定主因子數(shù)，以達(dá)到優(yōu)化模型目的。小葉章CP、EE、NDF和ADF的最佳光譜處理方法和譜區(qū)范圍見(jiàn)表2。

表2 建立近紅外光譜預(yù)測(cè)模型的最佳條件Table 2 Optimal conditions for establishing NIRS prediction models

2.3 模型的建模效果分析

根據(jù)相對(duì)分析誤差RPD（SD/RMSEP）值對(duì)模型進(jìn)行詳細(xì)評(píng)價(jià)。如果RPD≥3，說(shuō)明定標(biāo)效果良好，建立的定標(biāo)模型可以用于實(shí)際檢測(cè)；如果2.5＜RPD＜3，說(shuō)明利用NIRS對(duì)該成分進(jìn)行定量分析可行，但預(yù)測(cè)精度有待進(jìn)一步提高；如果RPD＜2.5，說(shuō)明該成分難于進(jìn)行NIRS定量分析[12-13]。

表3為在選擇最佳建模光譜范圍和光譜預(yù)處理方法后，得到的小葉章干草各指標(biāo)含量校正模型的建模參數(shù)和驗(yàn)證效果，其中CP、EE、NDF和ADF含量的校正模型的建模相關(guān)系數(shù)R2分別為0.9587、0.9654、0.9638和0.9553，均達(dá)到0.95以上，RMSEP分別為0.24、0.31、0.82和0.84，接近化學(xué)分析的準(zhǔn)確度，并且這4項(xiàng)指標(biāo)的RPD值均大于3，說(shuō)明近紅外校正模型具有較好預(yù)測(cè)效果，能較好地滿足實(shí)際生產(chǎn)中對(duì)分析精度的要求。

表3 CP、EE、NDF和ADF預(yù)測(cè)模型的優(yōu)化結(jié)果Table 3 Optimization results for the calibration of Prediction model CP,EE,NDF and ADF contents

校正模型建立后，采用外部驗(yàn)證的方法對(duì)所建模型的預(yù)測(cè)效果進(jìn)行驗(yàn)證。表4為用預(yù)測(cè)模型對(duì)60個(gè)小葉章樣品CP、EE、NDF和ADF含量預(yù)測(cè)結(jié)果。從表中可以看出預(yù)測(cè)樣品各指標(biāo)預(yù)測(cè)值與常規(guī)分析值之間差異不顯著。預(yù)測(cè)均方差（RMSEP）分別為0.55（CP）、0.42（EE）、1.46（NDF）和 1.23（ADF）。散點(diǎn)圖2表明，小葉章CP、EE、NDF和ADF預(yù)測(cè)值與化學(xué)值之間的相關(guān)系數(shù)（R2）分別為0.952 3、0.953 7、0.955 5和0.952 0，表明預(yù)測(cè)值與化學(xué)值比較接近，檢測(cè)誤差小、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用NIRS技術(shù)來(lái)對(duì)小葉章樣品中的CP、EE、NDF和ADF含量進(jìn)行實(shí)際預(yù)測(cè)。

表4 校正模型的驗(yàn)證Table 4 Evaluation of the calibration models with validation sets

圖2 CP、EE、NDF、ADF測(cè)量值與預(yù)測(cè)值的相關(guān)性Fig.2 Correlation between measured and predicted values CP,EE,NDF and ADF

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于NIRS技術(shù)分析青貯飼料、紫花苜?；瘜W(xué)成分研究較多。董蘇曉等研究表明，近紅外漫反射光譜法可測(cè)定新鮮青貯飼料中干物質(zhì)DM、NDF、ADF和粗灰分（CA）含量；CP含量測(cè)定效果較好，需要通過(guò)擴(kuò)大樣品CP含量變異范圍進(jìn)一步驗(yàn)證；可粗略估測(cè)酸性洗滌木質(zhì)素（ADL）和可溶性碳水化合物（WSC）含量，測(cè)定精度有待于提高[14]。齊曉等采用FT-NIRS，結(jié)合PLS，建立紫花苜蓿莖組分CP、NDF、ADF、CA和體外可消化干物質(zhì)（IVDDM）含量預(yù)測(cè)模型，除NDF含量的預(yù)測(cè)模型外，其他4個(gè)指標(biāo)預(yù)測(cè)模型建模效果和實(shí)際預(yù)測(cè)均較好[8]?；瑯s等運(yùn)用PLS建立紫花苜蓿草顆粒CP、NDF和ADF含量近紅外光譜預(yù)測(cè)模型，表明近紅外光譜分析技術(shù)可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)紫花苜蓿草顆粒的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[13]。陳鵬飛等應(yīng)用PLS、傅里葉變換近紅外光譜技術(shù)（FT-NIRS）和液氮冷凍制樣技術(shù)，建立適合于不同品種、不同生育期、不同茬次和不同青貯方法即時(shí)測(cè)定青貯苜蓿鮮樣中DM、CP、NDF、ADF的模型，結(jié)果表明采用適當(dāng)?shù)臉悠诽幚矸椒ê凸庾V分析技術(shù)可實(shí)現(xiàn)近紅外光譜技術(shù)對(duì)苜蓿青貯鮮樣營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)定[15]。尚晨以152個(gè)來(lái)源不同的紫花苜蓿樣品建立粗蛋白和粗纖維含量近紅外定量分析校正模型，表明利用近紅外漫反射光譜法測(cè)定紫花苜蓿內(nèi)在主要品質(zhì)性狀可行[16]。

對(duì)于NIRS應(yīng)用于小葉章?tīng)I(yíng)養(yǎng)價(jià)值快速定量檢測(cè)尚屬首例，本試驗(yàn)采用PLS方法，建立小葉章CP、EE、NDF和ADF含量的預(yù)測(cè)模型，檢測(cè)誤差小、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，與化學(xué)分析方法無(wú)明顯差異且重現(xiàn)性好，表明近紅外漫反射光譜法可快速并準(zhǔn)確測(cè)定小葉章中CP、EE、NDF和ADF含量。同時(shí)，本試驗(yàn)使用TQ Analyst 6.2分析軟件進(jìn)行光譜預(yù)處理，在建模之前對(duì)建模光譜信息進(jìn)行選擇，提高了建模光譜數(shù)據(jù)有效信息率，獲得小葉章?tīng)I(yíng)養(yǎng)價(jià)值最佳的光譜處理方法和譜區(qū)范圍。同時(shí)，本試驗(yàn)采用較大的樣品量，在一定程度上提高近紅外建模準(zhǔn)確性。后續(xù)研究中，可增加有代表性樣品，增大樣品品種、地域、年際變化、物理形態(tài)等變異條件，拓寬預(yù)測(cè)范圍，既能建立包括大量變異寬范圍預(yù)測(cè)模型，也可以用少量樣品建立準(zhǔn)確專用模型。

4 結(jié)論

采用偏最小二乘法（PLS）建立小葉章CP、EE、NDF和ADF含量的近紅外光譜定量分析校正模型，小葉章CP的預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)（R2）達(dá)到0.9523、SD/RMSEP達(dá)到3.51；EE的預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)0.9537、SD/RMSEP達(dá)到3.05；NDF預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)達(dá)0.9555、SD/RMSEP達(dá)到3.12；ADF預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)0.9520、SD/RMSEP達(dá)到3.15，表明近紅外漫反射光譜法可快速并準(zhǔn)確的測(cè)定小葉章中CP、EE、NDF和ADF含量。

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