姜巨全，黃海鵬，孟 婧，胡寶忠

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，大豆生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

細(xì)菌在細(xì)胞質(zhì)膜上進(jìn)行能量轉(zhuǎn)化過程中，質(zhì)子是主要偶聯(lián)離子[1-2]。許多初級鈉離子泵借助膜內(nèi)外鈉離子梯度行使功能同時(shí)偶聯(lián)質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)[3]。次級鈉氫逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白則會以跨膜質(zhì)子電化學(xué)梯度為驅(qū)動力確立鈉離子濃度梯度[4]。偶聯(lián)鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)脫羧酶作為一個(gè)酶家族，在細(xì)菌質(zhì)膜上催化脫羧反應(yīng)進(jìn)行能量轉(zhuǎn)化同時(shí)，偶聯(lián)鈉離子、質(zhì)子跨膜運(yùn)輸，屬于初級鈉離子泵。該酶家族主要包括：草酰乙酸脫羧酶（Oxaloacetate decarboxylase）[5-6]、甲基丙二酰輔酶A脫羧酶（Methylmalonyl-CoA decar?boxylase）[7]、戊烯二酰輔酶A脫羧酶（Glutaconyl-CoA decarboxylase）[8]、丙二酸鹽脫羧酶（Malonate decarboxylase）[9]。其中草酰乙酸脫羧酶是該羧酶家族中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有初級鈉離子泵活性脫羧酶[10]。

草酰乙酸脫羧酶分為細(xì)胞質(zhì)型和質(zhì)膜型兩種。前者不具有偶聯(lián)鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能，首先在溶壁微球菌（Microcococcus lysodeikticus）中被發(fā)現(xiàn)[11]，并在乳球菌屬（Lactococcus）[12-13]、假單胞菌屬（Pseudomonas）[14]及棒狀桿菌屬（Corynebacterium）[15-16]等多個(gè)細(xì)菌屬中相繼被鑒定。后者具有偶聯(lián)鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能，最早在產(chǎn)氣克萊勃氏桿菌（Klebsiella aerogenes）中被發(fā)現(xiàn)，其生理學(xué)基本特征被初步鑒定[10]，繼而在其他腸道致病細(xì)菌如霍亂弧菌（Vibrio cholerae）[17]、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）[18]等中被發(fā)現(xiàn)和鑒定。本實(shí)驗(yàn)室在松嫩平原鹽堿地中分離得到一株中度嗜鹽鹽單胞菌新種并將其命名Halomonas songnenensis，利用基因功能互補(bǔ)與基因文庫技術(shù)相結(jié)合方法，從該菌基因組上克隆得到一個(gè)編碼偶聯(lián)鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)草酰乙酸脫羧酶基因簇oadGAB，目前正在對該酶活性以及鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制進(jìn)行鑒定。目前為止，肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）中草酰乙酸脫羧酶偶聯(lián)鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)脫羧反應(yīng)機(jī)制已被詳細(xì)地進(jìn)行分析。本文綜述具有偶聯(lián)鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)草酰乙酸脫羧酶生理學(xué)基本特征及其亞基結(jié)構(gòu)，以及拓?fù)洚悩?gòu)學(xué)、氨基酸定點(diǎn)突變等方法所獲得該酶鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)脫羧反應(yīng)機(jī)制研究進(jìn)展。

1 草酰乙酸脫羧酶在檸檬酸發(fā)酵途徑中關(guān)鍵作用

1.1 檸檬酸發(fā)酵途徑

檸檬酸通過偶聯(lián)鈉離子輸出被攝入菌體，在檸檬酸裂解酶催化作用下分解為草酰乙酸和醋酸[19]。草酰乙酸被質(zhì)膜上草酰乙酸脫羧酶脫羧，生成丙酮酸，同時(shí)脫羧反應(yīng)偶聯(lián)兩個(gè)鈉離子排出到細(xì)胞外。丙酮酸被進(jìn)一步分解為乙酰輔酶A和甲酸，緊接著乙酰輔酶A反應(yīng)形成乙酰磷酸。乙酰磷酸最后生成醋酸，反應(yīng)過程中催化ADP生成ATP。在這個(gè)反應(yīng)途徑中，用于生物合成反應(yīng)NADH合成尤為重要。肺炎克雷伯菌生長在高氧化檸檬酸基質(zhì)中時(shí)必須為生物合成反應(yīng)合成NADH，而這在檸檬酸循環(huán)中是不可行，因?yàn)棣镣於崦摎涿负铣蓵蝗毖跻种疲哂歇?dú)特的NADH生物合成途徑：甲酸氫裂解酶產(chǎn)生氫氣，然后經(jīng)一個(gè)膜上氫化酶催化氫氣和NAD+，生成NADH[20]。在檸檬酸發(fā)酵途徑中，每消耗1 mol檸檬酸，生成一個(gè)1 mol ATP，同時(shí)行成一個(gè)鈉離子電化學(xué)梯度。之后，這種電化學(xué)梯度被電中性檸檬酸鈉：氫同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白利用，驅(qū)動向胞內(nèi)運(yùn)送檸檬酸。

1.2 基因組成

檸檬酸發(fā)酵途徑所必需基因在肺炎克雷伯菌基因組上共同組成一個(gè)基因簇[21-22]，正向組成包括編碼檸檬酸鈉：氫同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白citS基因，以及跟隨在其后面由編碼草酰乙酸脫羧酶oadGAB基因和編碼一個(gè)雙組份調(diào)控系統(tǒng)citA/B基因。反方向組成包括編碼檸檬酸裂解酶連接酶citC基因和編碼檸檬酸裂合酶三個(gè)亞基citDEF基因以及編碼一個(gè)參與檸檬酸裂合酶生物素合成酶citG基因[23]。有研究指出肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）中有關(guān)檸檬酸發(fā)酵途徑基因在不同菌株中呈現(xiàn)出遺傳基因多樣性，而該多樣性與不同生長環(huán)境存在營養(yǎng)物質(zhì)多樣性關(guān)系很大[24]。

2 草酰乙酸脫羧酶亞基

2.1 亞基組成

草酰乙酸脫羧酶由三個(gè)不同亞基α、β、λ以1∶1∶1 比例組成[25-26]。如圖 1 所示，外圍α亞基（63.5 ku）包含兩個(gè)不同結(jié)構(gòu)域，即N端羧基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域和C端生物素結(jié)合結(jié)構(gòu)域[5]。一個(gè)富含脯氨酸和丙氨酸肽鏈連接著生物素在這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域間置換。肽鏈上距C端35個(gè)氨基酸殘基處，生物素以共價(jià)鍵連接在一個(gè)賴氨酸殘基上。草酰乙酸脫羧酶β亞基（44.9 ku）呈強(qiáng)疏水性，緊密結(jié)合在質(zhì)膜上[6]。γ亞基（8.9 ku）由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，N端錨定在質(zhì)膜上，由一個(gè)脯氨酸和丙氨酸鏈與親水C端結(jié)構(gòu)域相連接[27]。C端包含有一個(gè)多組氨酸結(jié)構(gòu)，為綁定在C端二價(jià)鋅離子提供配體[28-29]。由于γ亞基不僅與水溶性α亞基蛋白相互作用，同時(shí)也與質(zhì)膜上β亞基蛋白相互協(xié)調(diào)，γ亞基對草酰乙酸脫羧酶多亞基復(fù)合體穩(wěn)定性具有重要作用[29]。

草酰乙酸脫羧酶可以被分離純化，提取方法大體分兩步，先利用去垢劑從膜上溶解下草酰乙酸脫羧酶蛋白，然后通過相應(yīng)抗生素蛋白瓊脂糖柱進(jìn)行親和色譜層析[25]。肺炎克雷伯菌草酰乙酸脫羧酶三亞基復(fù)合體，通過誘導(dǎo)表達(dá)已在大腸桿菌中被成功合成，為利用突變方法對其進(jìn)行研究提供便利，并且雙亞基復(fù)合體αγ和βγ也已在試驗(yàn)中得到克隆、表達(dá)和分離[29]。

圖1 草酰乙酸脫羧酶全景幾何構(gòu)型及其酶促反應(yīng)特征Fig.1 Overall geometry of the oxaloacetate decarboxylase and features of the catalytic reactions

2.2 亞基作用

草酰乙酸脫羧酶催化反應(yīng)循環(huán)始于草酰乙酸被結(jié)合到α亞基羧基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域上[25]，隨后，草酰乙酸羧基被轉(zhuǎn)移到生物素上，經(jīng)過富有韌性脯氨酸丙氨酸鏈置換作用，羧化生物素從α亞基上羧基轉(zhuǎn)移酶位點(diǎn)移動到β亞基上脫羧酶位點(diǎn)[30]。在羧基生物素脫羧過程中，一個(gè)由膜外導(dǎo)入質(zhì)子被消耗，同時(shí)兩個(gè)鈉離子被泵入周質(zhì)空間[31]。這一系列生物化學(xué)反應(yīng)與其蛋白構(gòu)象變化緊密相關(guān)。例如，在兩個(gè)起催化作用結(jié)構(gòu)域間置換生物素組分可能負(fù)責(zé)開啟和關(guān)閉鈉離子通道，這些構(gòu)象變化在空間和時(shí)間上與生化反應(yīng)協(xié)調(diào)一致，對整個(gè)脫羧反應(yīng)具有至關(guān)重要作用。

3 Zn2+在羧基轉(zhuǎn)移酶催化反應(yīng)中作用

草酰乙酸脫羧酶中，每1 mol脫羧酶都含有1 mol緊密結(jié)合在γ亞基上Zn2+[32]。Zn2+在羧基轉(zhuǎn)移酶催化反應(yīng)時(shí)起到重要作用[33]。它協(xié)調(diào)作用于草酰乙酸上碳、氧原子，使氧原子因吸引與其相鄰碳原子所共用電子而帶負(fù)電，從而促進(jìn)草酰乙酸上C-C基斷裂，分解生成丙酮酸和羧化生物素[32]。將草酰乙酸脫羧酶α亞基置于含14C標(biāo)記草酰乙酸環(huán)境中，嘗試通過檢測含14C標(biāo)記羧基生物素蛋白量監(jiān)控羧基轉(zhuǎn)運(yùn)反應(yīng)。但是，羧基轉(zhuǎn)運(yùn)反應(yīng)速率過低，以致于無法準(zhǔn)確地監(jiān)測羧基轉(zhuǎn)移酶生理學(xué)活性。當(dāng)加入γ亞基后，羧基轉(zhuǎn)運(yùn)反應(yīng)速率大大提高，羧基轉(zhuǎn)移酶活性可被監(jiān)測到[29]。在γ亞基D62A和H77A突變株中，脫羧酶中Zn2+含量降到野生型35%和10%，當(dāng)突變刪除γ亞基C末端殘基H82和P83時(shí)，酶中Zn2+含量降低5%。當(dāng)相對應(yīng)Zn2+含量減少時(shí)，這些突變株中草酰乙酸脫羧酶活性喪失[34]。在霍亂弧菌中，當(dāng)突變猜測Zn2+離子配體γ亞基A17、H207、H209時(shí)，脫羧酶完全喪失活性[35]。這些結(jié)果一致說明γ亞基同它Zn2+在羧基轉(zhuǎn)運(yùn)催化機(jī)制中起著重要作用。

4 膜上β亞基拓?fù)洚悩?gòu)學(xué)分析

膜蛋白拓?fù)鋵W(xué)分析是描述一個(gè)跨膜蛋白跨膜片段數(shù)量、方向以及C端與N端分布。草酰乙酸脫羧酶β亞基是由433個(gè)氨基酸殘基組成疏水性蛋白，疏水性分析顯示，它具有9至10個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)。在推測跨膜區(qū)中，選擇多個(gè)位點(diǎn)打斷目蛋白肽鏈，使之與堿性磷酸酶或β-半乳糖苷酶形成融合蛋白，通過檢測融合點(diǎn)位置分析整個(gè)蛋白跨膜情況。

4.1 β亞基上主要螺旋蛋白及組成

β亞基拓?fù)淠Ｐ惋@示，它具有一個(gè)N末端在膜內(nèi)細(xì)胞質(zhì)一側(cè)，一個(gè)C末端在膜外周質(zhì)一側(cè)，整個(gè)蛋白折疊在一起鑲嵌在膜上，存在三個(gè)跨膜N末端螺旋，并由一個(gè)較大胞質(zhì)環(huán)連通著螺旋Ⅱ和螺旋Ⅲ。進(jìn)一步拓?fù)鋵W(xué)分析表明，β亞基C末端部分由6個(gè)螺旋折疊形成，它N末端和C末端之間蛋白部分呈現(xiàn)出一個(gè)不規(guī)則折疊，為Ⅲa區(qū)域[36]。

4.2 β亞基上具有重要作用Ⅲa跨膜域

氨基酸殘基179～189之間肽段構(gòu)成一個(gè)環(huán)（見圖2），該肽段氨基酸殘基并不是完全保守，因?yàn)槠渲胁糠职被釟埢谙嚓P(guān)脫羧酶家族成員中并不存在。拓?fù)鋵W(xué)分析表明，這一肽段應(yīng)該定位在膜周質(zhì)空間，這就排除Ⅲa區(qū)域會折疊成兩個(gè)跨膜螺旋可能。有研究暗示，Ⅲa肽段是從靠近周質(zhì)空間膜表面嵌入質(zhì)膜中，但并沒有完全穿透膜至靠近細(xì)胞質(zhì)一側(cè)膜表面（見圖2）[36]。Ⅲa跨膜域極特殊重要性，不僅在于其C端在膜上特殊折疊方式，更是因?yàn)槠浒粋€(gè)重要氨基酸殘基D203，該殘基定位于草酰乙酸脫羧酶β亞基中由7個(gè)連貫非變異氨基酸殘基構(gòu)成最保守區(qū)域內(nèi)（見圖2）[30]。

圖2 草酰乙酸脫羧酶β亞基內(nèi)特定位點(diǎn)氨基酸突變Fig.2 Location of the amino acids within the β subunit of oxaloacetate decarboxylas which have been changed by site-directed mutagenesis

5 基于定點(diǎn)突變β亞基功能研究

為鑒定草酰乙酸脫羧酶β亞基上重要氨基酸殘基功能，可以使用氨基酸定點(diǎn)突變方法，通過研究突變株特性來分析突變意義。β亞基肽鏈上保守氨基酸殘基被認(rèn)為在功能上具有重要作用，尤其是鑲?cè)肽ど息骯區(qū)域極性氨基酸殘基，它們可能是鈉離子和氫離子跨膜運(yùn)輸最主要參與者。

5.1 β亞基上主要突變位點(diǎn)及鈉離子泵活性鑒定

圖2簡要標(biāo)注β亞基（OadB）上所有被突變過氨基酸殘基[10,16,22]。其中，氨基酸殘基D203、Y229、G377、S382中任何一個(gè)突變都導(dǎo)致草酰乙酸脫羧酶活性完全喪失，N373、R389突變大幅度地降低脫羧活性，而在其他位點(diǎn)如T148、G200、Y227、G380等突變并未明顯影響草酰乙酸脫羧酶活性。D203（Ⅲa區(qū)域）[10]、Y229（螺旋Ⅳ）[22]、和G377或S382（螺旋Ⅷ）[16]等突變可使草酰乙酸脫羧酶活性降低，甚至完全喪失。

5.2 D203對β亞基功能作用

首個(gè)被鑒定出對于酶活性不可缺少功能性氨基酸殘基是Ⅲa區(qū)域D203，即將203處保守天冬氨酸轉(zhuǎn)為E、N、Q，均導(dǎo)致草酰乙酸脫羧酶完全喪失活性，并且突變后酶同時(shí)喪失初級鈉離子泵活性[23]。鈉離子泵活性是通過與大腸桿菌EP432（被敲出鈉氫逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因大腸桿菌突變株菌株，不能在含鹽350 mmol·L-1pH6葡萄糖礦物鹽培養(yǎng)基上生長）功能互補(bǔ)試驗(yàn)來檢測。野生型草酰乙酸脫羧酶基因轉(zhuǎn)化EP432后，因具有初級鈉離子泵活性可恢復(fù)其在高鹽環(huán)境中生長能力[16]。然而，D203突變株草酰乙酸脫羧酶缺失初級鈉離子泵活性，故不能與EP432進(jìn)行功能互補(bǔ)恢復(fù)其在高鈉離子濃度下生長。

草酰乙酸脫羧酶α亞基催化羧基轉(zhuǎn)移酶活性，不會被β亞基D203突變所影響[13]，這個(gè)酶可快速地催化14CO2從（4-14C）草酰乙酸上轉(zhuǎn)移到共價(jià)生物素組分上[10]。因D203突變徹底敲出羧基生物素脫羧活性，生成含14C標(biāo)記羧基生物素即使在鈉離子環(huán)境中也很穩(wěn)定。而在野生型酶中，羧基生物素酶會被立即脫羧而不能形成一個(gè)穩(wěn)定中間產(chǎn)物。因此，D203對羧基生物素脫羧反應(yīng)必不可少，而鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)是與此偶聯(lián)。D203可能提供一個(gè)雙重作用，為轉(zhuǎn)運(yùn)溶解鈉離子而提供結(jié)合位點(diǎn)和作為質(zhì)子運(yùn)送載體，引導(dǎo)質(zhì)子反方向運(yùn)動到達(dá)催化反應(yīng)位點(diǎn)以備羧基生物素脫羧反應(yīng)[10]。

5.3 S382對β亞基功能作用

羧基生物素脫羧反應(yīng)及鈉離子泵也同樣依靠螺旋Ⅷ上S382。當(dāng)這個(gè)氨基酸殘基被突變?yōu)锳、C、E、N或Q，即使在保留羧基轉(zhuǎn)運(yùn)活性情況下，草酰乙酸脫羧酶和鈉泵活性也會完全消除[16]。而當(dāng)將S382突變?yōu)楸Ｊ豑時(shí)，草酰乙酸脫羧酶會保持脫羧活性和鈉離子泵活性，在S382突變?yōu)镈時(shí)，這些活性會降低。突變株表現(xiàn)出酶活力對于研究S382在鈉泵及羧基生物素脫羧中作用有重要指導(dǎo)意義。

所有在位點(diǎn)382可接納氨基酸殘基都攜帶一個(gè)羥基組分或一個(gè)酸性位點(diǎn)（S、T或D），這個(gè)結(jié)構(gòu)可以使其轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)子到催化反應(yīng)位點(diǎn)，從而啟動羧基生物素脫羧反應(yīng)[16]。位點(diǎn)382也可能是鈉離子結(jié)合位點(diǎn)，因?yàn)楫?dāng)S382→E時(shí)，延長同方向氨基酸殘基側(cè)鏈，可能會通過擾亂這一范圍中無機(jī)鹽離子可溶性協(xié)調(diào)，使得鈉離子不能結(jié)合，從而導(dǎo)致此突變株喪失活性。所以，S382可能具有雙重作用：當(dāng)可溶性鹽離子被由胞質(zhì)運(yùn)入膜時(shí)，作為離子結(jié)合位點(diǎn)；而當(dāng)質(zhì)子被引導(dǎo)反方向運(yùn)送由周質(zhì)至膜上催化位點(diǎn)時(shí)，作為氫結(jié)合位點(diǎn)。所以，S382同D203具有相似功能，而且這兩個(gè)氨基酸殘基都可能是膜上鈉氫轉(zhuǎn)運(yùn)網(wǎng)絡(luò)重要部分。為起到質(zhì)子傳導(dǎo)功能，S382富含羥基側(cè)鏈必須要在質(zhì)子化和去質(zhì)子化間轉(zhuǎn)變。在水環(huán)境中，絲氨酸羧基組分PK＞13,因此在生理學(xué)條件下不會發(fā)生去質(zhì)子化[16]。然而，就如同絲氨酸蛋白酶對絲氨酸作用一樣，去質(zhì)子化可以在酶中疏水空間內(nèi)，通過組氨酸和天冬氨酸成對作用來完成。

5.4 β亞基上R389功能推測

負(fù)責(zé)從β亞基上S382接收質(zhì)子，可能是羧基生物素配體R389。R389氨基酸殘基處在兩個(gè)螺旋上，繞開S382朝向膜胞質(zhì)一側(cè)，這兩個(gè)氨基酸殘基都將它們側(cè)鏈暴露在同一方向。R389非常保守，S382和R389在傳導(dǎo)質(zhì)子路徑方面，有密切作用相互關(guān)系[17]。R389→K突變株表現(xiàn)出與野生型幾乎相同草酰乙酸脫羧酶活性，同時(shí)也具有鈉泵活性。在pH 9時(shí)，R389→C活性會降低，而當(dāng)降低到野生型最適pH 6.5時(shí)，酶活性得以恢復(fù)[25]。當(dāng)pH值由最適pH值提高兩個(gè)單位時(shí)，對比R389→A、R389→L突變株與野生型酶活性，推測質(zhì)子可能由S382經(jīng)過R389傳遞給羧基生物素，從此處開啟這個(gè)酸性復(fù)合物脫羧反應(yīng)[16]。

5.5 β亞基上保守Y227和Y229重要性

β亞基上有兩個(gè)保守酪氨酸殘基，是在螺旋Ⅳ上Y227和Y229。如果將酪氨酸227突變成丙氨酸，則草酰乙酸脫羧酶活性從45 U·mg-1（野生型）降到0.5 U·mg-1，而突變株Y227→C和Y227→F酶活力更高一些，其酶活力分別降到12和9 U·mg-1[22]。因此，Y227對于保證酶高效催化作用是十分重要。而酪氨酸229對于酶重要性表現(xiàn)在，即使用苯基丙氨酸對酪氨酸做很保守交換，都會完全使其失去草酰乙酸脫羧酶活性和鈉泵活性[37]。

6 能量偶聯(lián)分子模型

圖3為草酰乙酸脫羧酶能量偶聯(lián)機(jī)制工作模型[31,38]。在這個(gè)模型中，β亞基上標(biāo)示兩個(gè)不同鈉離子結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)位于D203，另一個(gè)位于S382。在Ⅲa部分中，螺旋Ⅳ和螺旋Ⅷ排列成一個(gè)膜上疏水空間，為鈉離子和氫離子相互反向跨膜移動提供通道[39-40]。這個(gè)離子通道被預(yù)測擁有兩種不同構(gòu)象：構(gòu)象1是使鈉離子結(jié)合位點(diǎn)朝向細(xì)胞周質(zhì)，而構(gòu)象2則是當(dāng)一階段催化反應(yīng)完成后，鈉離子結(jié)合位點(diǎn)朝向胞質(zhì)。

6.1 伴隨構(gòu)象變化離子運(yùn)輸途徑

在α亞基上，催化反應(yīng)循環(huán)始于羧基轉(zhuǎn)移酶催化草酰乙酸提供羧基給生物素組分進(jìn)行羧化反應(yīng)。在圖3A中，羧基生物素被氨基酸殘基遞送到并結(jié)合在β亞基上脫羧酶催化位點(diǎn)。跨膜螺旋Ⅷ上，接近于胞質(zhì)膜表面R389對堿性離子有較強(qiáng)吸引力，它不僅對羧基生物素與催化位點(diǎn)結(jié)合起到促進(jìn)作用，同時(shí)還對此時(shí)構(gòu)象1起到穩(wěn)固作用。S382是質(zhì)子傳遞指揮網(wǎng)絡(luò)一部分，這個(gè)網(wǎng)絡(luò)還包含Y229、R389、H2O和羧基生物素[37]。當(dāng)?shù)谝粋€(gè)鈉離子結(jié)合到Asp203上后，第二個(gè)鈉離子結(jié)合到S382，如圖3B所示。此時(shí)，R389同羧基生物素協(xié)同催化作用S382，降低S382pK值，如同絲氨酸蛋白酶上組氨酸和天冬氨酸共同催化絲氨酸一樣，使其更易去質(zhì)子化[37]。鈉離子由胞質(zhì)膜通道接近S382，在β亞基中形成疏水環(huán)境下，取代S382側(cè)鏈羥基上氫，重新形成離子對。這種取代會引起質(zhì)子傳遞網(wǎng)絡(luò)中氫重排，最后將一個(gè)質(zhì)子傳遞給羧基生物素來催化這個(gè)酸性不穩(wěn)定混合物立即脫羧。

如圖3C所示，這一系列質(zhì)子傳遞最終會引起整個(gè)蛋白模型構(gòu)象變化，模型轉(zhuǎn)化為構(gòu)象2，胞質(zhì)膜通道關(guān)閉，周質(zhì)膜通道打開。一個(gè)周質(zhì)膜外質(zhì)子由此通道進(jìn)入，將最先結(jié)合在接近周質(zhì)膜表面D203上，使其釋放第一個(gè)鈉離子，隨后被傳送到S382，釋放第二個(gè)鈉離子，從而恢復(fù)S382羥基組分。D203和S382上鈉離子被釋放后，經(jīng)過通道，到達(dá)膜外周質(zhì)[40]。在所預(yù)測分子模型中，D203和S382是質(zhì)子轉(zhuǎn)移途徑中心和樞紐，這同樣與定點(diǎn)突變結(jié)果相一致，即二者之中任何一個(gè)氨基酸殘基突變，脫羧活性將完全喪失[30-31]。由圖3D→A所示，緊接著，α亞基上羧基轉(zhuǎn)移酶作用草酰乙酸加工生成羧基生物素將重新結(jié)合到β亞基上，模型恢復(fù)到穩(wěn)定構(gòu)象1，開始一個(gè)新反應(yīng)循環(huán)。

圖3 羧基生物素脫羧基反應(yīng)過程偶聯(lián)鈉氫離子跨膜運(yùn)輸機(jī)制分子演示模式圖Fig.3 Model for coupling Na+and H+movements across the membrane to the decarboxylation of carboxybiotin

6.2 草酰乙酸脫羧酶能量偶聯(lián)分子機(jī)制特點(diǎn)

在草酰乙酸脫羧酶鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)反應(yīng)循環(huán)中，有兩個(gè)鈉離子被由胞質(zhì)運(yùn)送至細(xì)胞周質(zhì)，一個(gè)來自細(xì)胞周質(zhì)質(zhì)子在羧基生物素脫羧時(shí)被利用[41]。氨基酸殘基N373可以看作是D203配體，兩個(gè)殘基都位于周質(zhì)膜表面附近，它可能會協(xié)調(diào)促進(jìn)D203對鈉離子結(jié)合，N373→L、N373→D突變株都只保留很弱草酰乙酸脫羧酶活性。將R389突變?yōu)橹行园被酇或L后，可以檢測到酶活性降低，但不會完全喪失，即使R389→D突變株也會保留一部分活性[31]。

這個(gè)離子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制與所驗(yàn)證一個(gè)分子草酰乙酸對應(yīng)兩分子鈉離子外排[42]，同時(shí)會有一個(gè)分子質(zhì)子運(yùn)至膜內(nèi)是一致[30]。這個(gè)模型更揭示催化過程中化學(xué)和數(shù)量上對應(yīng)關(guān)系，同時(shí)說明生物素羧化和脫羧反應(yīng)是鈉離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)所必需。草酰乙酸脫羧反應(yīng)對鈉離子的依賴性在此也得到證實(shí)，因?yàn)镾382上質(zhì)子需要提供給脫羧反應(yīng)，而只有侵入鈉離子能替換下這個(gè)質(zhì)子[41]。運(yùn)用此模型也可以對草酰乙酸脫羧酶活性會被高鈉濃度和高pH值抑制作出解釋，因?yàn)樵诖藯l件下，很難從低親和力位點(diǎn)（膜上鈉離子親和位點(diǎn)）轉(zhuǎn)換到鈉離子，整個(gè)反應(yīng)過程會變得遲緩[30]。

7 問題與展望

草酰乙酸脫羧酶鈉泵偶聯(lián)機(jī)制主要特點(diǎn)是利用嵌入膜氨基酸殘基S382、D203-N373作為結(jié)合位點(diǎn)，及與其作用密切相關(guān)氨基酸殘基共同形成鈉離子、質(zhì)子傳遞網(wǎng)絡(luò)，引導(dǎo)鈉離子和氫相對方向定向運(yùn)動。由賴氨酸殘基連接生物素將草酰乙酸脫羧及羧基生物素脫羧這兩部分反應(yīng)在生化反應(yīng)能量傳遞上，及空間轉(zhuǎn)移上有機(jī)地結(jié)合在一起。能量偶聯(lián)分子模型被用以描述這一直接偶聯(lián)機(jī)制。在草酰乙酸脫羧酶β亞基中，鈉離子結(jié)合觸發(fā)質(zhì)子反向跨膜運(yùn)動到達(dá)催化位點(diǎn)，在這里它們被消耗在催化反應(yīng)中。

利用基因定點(diǎn)敲除技術(shù)，對突變處為D203、S382、Y229突變株研究從側(cè)面驗(yàn)證反應(yīng)機(jī)制模型，證明這些殘基組成質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)通道對催化作用至關(guān)重要。隨著研究深入，在分子結(jié)構(gòu)層面，對于某些氨基酸殘基作用，存在許多新問題。如S382可以被D取代，但卻不能被N、E或Q取代，由于其必須為鈉離子提供結(jié)合位點(diǎn)，所以是否是在其鏈延伸方向上，氨基酸殘基側(cè)鏈長度起到至關(guān)重要作用；G377也是β亞基上一個(gè)關(guān)鍵殘基，它的突變株完全失去脫羧酶活性，但目前對其研究較少，只是認(rèn)為其在結(jié)構(gòu)上起重要作用。在生化反應(yīng)層面，以分子結(jié)構(gòu)研究為基礎(chǔ)，使通過對基因序列改變來正向調(diào)節(jié)脫羧酶活性及對鈉離子運(yùn)輸能力成為可能。草酰乙酸脫羧酶作為重要初級鈉離子泵之一，隨著對其偶聯(lián)鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)脫羧機(jī)制研究不斷深入，將為對其他鈉離子初級泵及次級泵研究提供更廣闊視野。同時(shí)，利用草酰乙酸脫羧酶鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)特性，對其異源表達(dá)以改造菌體耐鹽能力，將在構(gòu)造耐鹽工程菌株中產(chǎn)生重要作用。

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