路義鑫，林 宇,2，李鏑銳，汪 明

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京 100026；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100091）

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)是存在于牛羊等反芻動(dòng)物體內(nèi)的一種重要消化道寄生蟲(chóng)，呈世界性分布，國(guó)內(nèi)各省均有報(bào)道。黑龍江省是畜牧大省，每年因消化道線蟲(chóng)造成的損失巨大。1979～1985年黑龍江省畜禽寄生蟲(chóng)區(qū)系調(diào)查協(xié)作組調(diào)查發(fā)現(xiàn)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)寄生率和感染強(qiáng)度都很高，為黑龍江省優(yōu)勢(shì)種，并在全省分布[1]。1997年全國(guó)棟等調(diào)查黑龍江齊嫩地區(qū)牛感染率為96.2%；羊?yàn)?5%[2]。2003年3月～2004年12月，王春仁等在黑龍江省西部地區(qū)進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)感染率為37.1%[3]。目前，該病主要采用化學(xué)藥物治療，但由于藥物殘留、環(huán)境污染、抗藥性蟲(chóng)株出現(xiàn)和蔓延，使得傳統(tǒng)化學(xué)治療受到嚴(yán)重挑戰(zhàn)，迫切需要一種有效防治方法控制其感染和流行。H11是一種隱蔽抗原，具有氨基肽酶活性，是目前世界上公認(rèn)最好的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)疫苗候選抗原。國(guó)外學(xué)者Smith等對(duì)H11進(jìn)行克隆和表達(dá)[4]；國(guó)內(nèi)杜愛(ài)芳、嚴(yán)若峰等也對(duì)浙江、新疆蟲(chóng)株進(jìn)行相關(guān)研究[5-6]。本研究將對(duì)黑龍江（HLJ）株進(jìn)行克隆和表達(dá)，為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 蟲(chóng)種

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)HLJ株成蟲(chóng)，采自黑龍江省綿羊體內(nèi)。

1.1.2 菌種與質(zhì)粒

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α（購(gòu)自北京全式金生物工程有限公司）；pMD18-T載體（購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司）；表達(dá)載體pGEX-6P/1由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲(chóng)教研組保存。

1.1.3 工具酶與試劑

RNA提取純化試劑盒（購(gòu)自Promega公司）；Trizol（購(gòu)自Invitrogen公司）；膠回收試劑盒（購(gòu)自O(shè)mega公司）；質(zhì)粒小量提取試劑盒（購(gòu)自博大泰克公司）；RNasin（RNA酶抑制劑）、M-MLV Reverse Transcriptase（M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶）、TaqDNA聚合酶、dNTP、T4DNA連接酶及限制性內(nèi)切酶EcoR I、HandⅢ（等均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中已發(fā)表序列（登錄號(hào)∶X94187）為參考，設(shè)計(jì)一對(duì)引物P1和P2，擴(kuò)增H11基因開(kāi)放閱讀框；在對(duì)H11基因序列分析基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)一對(duì)表達(dá)引物P3和P4，擴(kuò)增H11基因胞外域。引物由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)總RNA提取和目基因擴(kuò)增

按照Promega公司試劑盒說(shuō)明書(shū)提取捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)總RNA。逆轉(zhuǎn)錄方法獲得cDNA。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（cDNA）利用25 μL體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得H11基因。純化后連接pMD18-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T-H11，送北京奧科生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。應(yīng)用軟件進(jìn)行序列分析和比較。

1.2.3 原核表達(dá)載體構(gòu)建

以P3、P4為引物，pMD18-T-H11為模板擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增獲得目的片段。將純化PCR產(chǎn)物和pGEX-6P-1載體進(jìn)行BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，產(chǎn)物用Omega膠回收試劑盒純化。連接轉(zhuǎn)化后，將初選質(zhì)粒進(jìn)行單、雙酶切和PCR鑒定。陽(yáng)性質(zhì)粒送生物公司測(cè)序。重組原核表達(dá)載體命名為pGEX-6P-1-H11。

1.2.4 目的基因誘導(dǎo)表達(dá)

將測(cè)序鑒定正確pGEX-6P-1-H11重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌Rosetta（DE3），37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落，接種于含AmpLB培養(yǎng)基中，37℃活化過(guò)夜后，1∶100稀釋到LB培養(yǎng)基中，37℃、250 r·min-1振搖培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期（OD600=0.6），加入終濃度為 1 mmol·L-1IPTG，于 37℃、250 r·min-1誘導(dǎo)6 h。于誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后3、4.5、6 h分別取出1 mL菌液，以5 000 r·min-1離心收集菌體，棄上清，進(jìn)行SDS-PAGE分析。

處理樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜（NC膜）上，以感染捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)陽(yáng)性血清作為一抗，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗羊IgG作為二抗進(jìn)行Western-blot分析，參見(jiàn)文獻(xiàn)[7]步驟進(jìn)行操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 H11基因RT-PCR擴(kuò)增

圖1為以P1和P為引物PCR擴(kuò)增捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)H11基因電泳圖。電泳結(jié)果顯示，所取樣品PCR產(chǎn)物在凝膠中跑出目的條帶，與DNA Marker比較可知H11大小為3 000 bp，這與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相吻合。初步確定擴(kuò)增出片段為目的基因。

圖1 H11基因RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 RT-PCR amplification result of H11 gene

2.2 H11基因克隆和鑒定

提取重組質(zhì)粒pMD18-T-H11 DNA樣品進(jìn)行PCR、單、雙酶切鑒定。經(jīng)BamHⅠ單酶切得到長(zhǎng)約5 700 bp一條帶，BamHⅠ、HandⅢ雙酶切得到長(zhǎng)約3 000和2 700 bp兩條帶，質(zhì)粒PCR長(zhǎng)約3 000 bp（見(jiàn)圖2）。證明為陽(yáng)性重組質(zhì)粒。

2.3 H11抗原基因序列分析

本試驗(yàn)測(cè)得捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)H11基因。測(cè)序結(jié)果表明PCR擴(kuò)增捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)H11基因由起始密碼子到終止密碼子核苷酸長(zhǎng)為2 919 bp，編碼972個(gè)氨基酸殘基。經(jīng)軟件分析，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)HLJ株H11與已知序列（X94187，Smith）同源性為99.14%，有25個(gè)堿基發(fā)生突變，在550、1 230、1 461、1 530、1 590位有堿基T→C突變，在1 272、1 587、1 681、1 832位有堿基G→A突變，在1 554、1 577、1 584、1 902、2 543位有堿基A→G突變，在1 694、1 722、1 777、1 860、2 217、2 444位有堿基C→T突變，在2 770位有堿基G→T突變，其余4個(gè)是同義突變；與已知序列（AY247714，嚴(yán)若峰）同源性為98.49%，有44個(gè)堿基發(fā)生突變，在292、1 270位有堿基C→A突變，在712、951、1 000、1 272、1 329、1 832、1 889、2 149、2 151、2 184位有堿基G→A突變，在928、1 026、2 199位有堿基A→C突變，在933、936、980、1 005、1 041、1 188、1 191、1 212、1 770、1 860、1 946、2 217位有堿基C→T突變，在942、977、1 062、1 901、2 543位有堿基A→G突變，在1 158、1 353、1 570、2 150、2 707位有堿基T→C突變，在2 770位有堿基G→T突變，其余6個(gè)是同義突變；與已知序列（AY819650，杜愛(ài)芳）同源性為99.59%，有12個(gè)堿基發(fā)生突變，在1 272、1 832位有堿基G→A突變，在1 770、1 860、2 217位有堿基C→T突變，在1 901、2 543、2 642位有堿基A→G突變，在2 770位有堿基G→T突變，其余3個(gè)是同義突變。

圖2 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)重組質(zhì)粒pMD18-T-H11PCR、酶切鑒定Fig.2 Identification of Haemonchus contortus recombinant plasmid pMD18-T-H11

經(jīng)生物信息學(xué)軟件分析（NetNGlyc 1.0 Server），H11基因含有4個(gè)糖基化位點(diǎn)和1個(gè)Zn結(jié)合功能域。4個(gè)糖基化位點(diǎn)分別位于99～102aa、227～230aa、549～552aa、858～861 aa處；Zn結(jié)合功能域位于376～385 aa處（見(jiàn)圖3）。

2.4 H11部分胞外域擴(kuò)增

在對(duì)H11基因序列分析基礎(chǔ)上，選取包含3個(gè)糖基化位點(diǎn)和1個(gè)Zn結(jié)合功能域，從451至2 919 bp一段序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物P3、P4，以pMD18-T-H11為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增，獲得一條約2 500 bp目的條帶（見(jiàn)圖4）。

圖3 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)H11基因生物信息分析結(jié)果Fig.3 Analyzed H11 gene of Haemonchus contortus by bioinformatics

圖4 H11部分胞外域PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR amplification result of H11 ECD gene

2.5 原核表達(dá)載體鑒定

提取重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-H11樣品進(jìn)行PCR、單、雙酶切鑒定。經(jīng)BamHⅠ單酶切得到長(zhǎng)約7 500 bp一條帶，BamHⅠ和SalⅠ雙酶切得到長(zhǎng)約5 000和2 500 bp兩條帶，質(zhì)粒PCR長(zhǎng)約2 500 bp（見(jiàn)圖5）。證明為陽(yáng)性重組質(zhì)粒。

2.6 H11部分胞外域原核表達(dá)

SDS-PAGE結(jié)果（見(jiàn)圖6）表明，采用1 mmol·L-1IPTG 37℃培養(yǎng)，pGEX-6P-1-H11可以誘導(dǎo)表達(dá)，在118 ku處出現(xiàn)特異性融合蛋白條帶。H11（415～2 919 bp）蛋白分子質(zhì)量約為92 ku，表達(dá)蛋白為帶有GST標(biāo)簽融合蛋白，GST分子質(zhì)量為26 ku，故推測(cè)融合蛋白分子質(zhì)量約為118 ku，與推測(cè)分子質(zhì)量大小相符。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)超聲波裂解后，融合蛋白主要存在于離心沉淀中，提示融合蛋白表達(dá)后以包涵體形式存在于菌體中。免疫印跡實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)目的條帶。

圖5 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-H11PCR、酶切鑒定Fig.5 Identification of Haemonchus contortus recombinant plasmid pGEX-6P-1-H11

圖6 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)H11部分胞外域基因重組蛋白SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of H11 ECD gene recombinant protein

3 討論與結(jié)論

H11是寄生階段捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)小腸微絨毛上皮細(xì)胞中一種跨膜糖蛋白，分子質(zhì)量為110 ku。Smith首先克隆H11基因，并進(jìn)行序列分析[5]。本試驗(yàn)根據(jù)GenBank上發(fā)表H.contortus（X94187）序列為設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR方法從捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)總RNA中特異性地?cái)U(kuò)增出H11基因，測(cè)序結(jié)果表明，H11基因由起始密碼子到終止密碼子核苷酸長(zhǎng)為2 919 bp，編碼972個(gè)氨基酸殘基。經(jīng)軟件分析，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)HLJ株H11與已知序列（X94187，Smith）同源性為99.14%，有25個(gè)堿基發(fā)生突變，其中4個(gè)是同義突變；與已知序列（AY247714，嚴(yán)若峰）同源性為98.49%，有44個(gè)堿基發(fā)生突變，其中6個(gè)是同義突變；與已知序列（AY819650，杜愛(ài)芳）同源性為99.59%，有12個(gè)堿基發(fā)生突變，其中3個(gè)是同義突變。這些差異與地域差異有關(guān)。黑龍江省位于中國(guó)東北部，無(wú)霜凍期短，年均氣溫低，外界環(huán)境在絕大多數(shù)時(shí)間里很難滿足蟲(chóng)體發(fā)育需求，蟲(chóng)體長(zhǎng)期以受阻幼蟲(chóng)形式存在于宿主體內(nèi)，為適應(yīng)不利生存環(huán)境可引起一定程度改變。

糖基化位點(diǎn)氨基酸組成特征為N-{P}-[ST]-{P}，鋅結(jié)合功能域氨基酸組成特征為[GSTALIVN]-{PCHR}-{KND}-H-E-[LIVMFYW]-{DEHRKP}-H-{EKPC}-[LIVMFYWGSPQ]。經(jīng)軟件分析，H11基因含有4個(gè)糖基化位點(diǎn)和1個(gè)Zn結(jié)合功能域。4個(gè)糖基化位點(diǎn)分別位于 99～102aa、227～230aa、549～552aa、858～861 aa處；Zn結(jié)合功能域位于376～385 aa處。糖基化位點(diǎn)能夠攜帶部分必需寄生蟲(chóng)特有保護(hù)性多肽，鋅結(jié)合功能域氨基酸可發(fā)揮中性鋅金屬肽酶活性，結(jié)果與張紅麗等[8]一致。

H11基因編碼蛋白分子質(zhì)量較大，體外表達(dá)較為困難。嚴(yán)若峰將H11基因分3段構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28/H11-1、pET28/H11-2、pET28/H11-3，并分別進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果H11-1和H11-2獲得較高水平表達(dá)，而H11-3未見(jiàn)明顯表達(dá)條帶；嚴(yán)若峰還將3段H11基因在巴斯德畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果可通過(guò)RT-PCR、SDS-PAGE、和Western blot檢測(cè)到目的基因表達(dá)，但培養(yǎng)上清中檢測(cè)不到目的蛋白表達(dá)。張紅麗等克隆捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)ZJ株H11抗原部分基因（包含2個(gè)糖基化位點(diǎn)和1個(gè)Zn結(jié)合功能域，從670到1 710 bp），構(gòu)建pET28b-HPS原核表達(dá)載體，結(jié)果獲得高效表達(dá)[8]。

本研究以pMD18-T-H11為模板成功克隆捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)HLJ株H11基因451到2 919 bp一段胞外域序列，包含3個(gè)糖基化位點(diǎn)和1個(gè)Zn結(jié)合功能域，并構(gòu)建pGEX-6P-1-H11原核表達(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌表達(dá)菌Rosetta（DE3）中成功表達(dá)，獲得預(yù)期結(jié)果。

H11是迄今為止從捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)腸道中分離到最具保護(hù)性隱蔽抗原，正常情況下不被機(jī)體免疫系統(tǒng)所識(shí)別，機(jī)體不對(duì)其產(chǎn)生免疫反應(yīng)，本研究以自然感染捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)綿羊陽(yáng)性血清進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)未出現(xiàn)目的條帶，證實(shí)H11確是一種隱蔽抗原，與嚴(yán)若峰結(jié)果相一致[8]。如何才能發(fā)揮H11免疫原性，有待深入研究。

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