李瑞芳，盧研博，陳士華，張慧茹，王 彬，熊前程

（河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州450001）

抗菌肽（antimicrobial peptides）又稱抗微生物肽或肽抗生素，是動物界和植物界的先天免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)分子，原指昆蟲體內(nèi)經(jīng)過誘導(dǎo)產(chǎn)生的分子量在4ku左右、具有抑菌性質(zhì)的堿性多肽物質(zhì)。從目前的研究來看，抗菌肽廣泛存在于多種生物體內(nèi)，具有廣譜抗菌、抗腫瘤、抗病毒活性，構(gòu)成機體的“第二防御體系”。因此，抗菌肽是存在于動植物、昆蟲、微生物等生物體內(nèi)，具有抗菌活性的肽類物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽水溶性好、分子質(zhì)量小、呈強堿性、熱穩(wěn)定性高、無免疫原性，有著與傳統(tǒng)抗生素完全不一樣的產(chǎn)生途徑和作用機制，病原菌不易對其產(chǎn)生耐藥性［1］。一般情況下，抗菌肽只作用于原核細胞和發(fā)生病變的真核細胞，而對常態(tài)的真核細胞幾乎沒有作用［2］。因此，抗菌肽有望被研發(fā)成替代抗生素的藥物，亦有可能成為無毒或低毒的抗腫瘤新藥［3］。肽類抗生素為新型藥物的設(shè)計提供了一個很有代表性的范例［4］。

嗜鉻粒蛋白（chromogranin A，CGA）是存在于動物神經(jīng)和內(nèi)分泌細胞的由439個氨基酸組成的可溶性蛋白［5］。CGA N端衍生多肽對真菌和細菌表現(xiàn)出不同的抑制作用，其中CGA N端31位～76位氨基酸肽段（CGA-N46）具有較強抗真菌的功能［6］。為揭示CGA-N46的抗真菌作用、副作用及選擇性毒力的基本原理，本實驗室正在對CGA-N46抗真菌作用機制進行研究。利用生物信息學(xué)軟件，對CGA-N46的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征等進行分析，通過與已有抗菌肽進行比對，推測CGA-N46的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 CGA-N46氨基酸序列 NH2-PMPVSQE CFETLRGHERILSILRHQNLLKE LQ-DL ALQGAKERAHQQ-COOH。

1.1.2 軟件和工具 ProtParam、TMpred和WoLF PSORT 工具，GOR4、SIMPA96、Signal3.0 Server、NetPhos 2.0Server和NetOGlyc 3.1Server軟件，SWISS-Model程序。

1.2 方法

1.2.1 CGA-N46理化性質(zhì)分析 利用http：／／www.expasy.ch／tools／網(wǎng)站ExPASy分析系統(tǒng)中的ProtParam工具分析CGA-N46氨基酸序列，對其氨基酸組成、電荷分布、電荷聚集區(qū)域、等電點、穩(wěn)定性、親水性和半衰期等理化參數(shù)進行分析。

1.2.2 CGA-N46二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用http：／／pbil.ibcp.fr／網(wǎng)站的secondary structure prediction軟件中的GOR4、SIMPA96方法綜合觀測CGAN46的二級結(jié)構(gòu)。

1.2.3 CGA-N46跨膜區(qū)和信號肽分析 參照文獻［7］，利用 http：／／www.ch.embnet.org／software／TMPRED＿form.html網(wǎng)站SWISS-PROT的跨膜蛋白數(shù)據(jù)庫Tmbase的分析工具TMpred和http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／網(wǎng)站Signal3.0 Server軟件分析CGA-N46氨基酸序列，預(yù)測其跨膜區(qū)段和取向。

1.2.4 CGA-N46進入細胞后的細胞內(nèi)定位 參照文獻［8］，利用網(wǎng)站http：／／psort.hgc.jp／form2.html的WoLF PSORT工具基于其氨基酸序列預(yù)測蛋白質(zhì)亞細胞定位點。

1.2.5 CGA-N46糖基化和磷酸化位點分析 利用http：／／www.cbs.dtu.dk／services／NetOGlyc／網(wǎng)站的NetOGlyc 3.1Server軟件和http：／／www.cbs.dtu.dk／services／NetPhos／網(wǎng) 站 的 NetPhos 2.0 Server軟件分析CGA-N46的糖基化和磷酸化位點。

1.2.6 CGA-N46三維空間結(jié)構(gòu)分析 利用http：／／swissmodel.expasy.org／repositoru／網(wǎng) 站 的SWISS-Model程序預(yù)測CGA-N46的三級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 CGA-N46的理化性質(zhì)

CGA-N46共有46個氨基酸，其氨基酸組成見表1。由軟件分析可知，CGA-N46內(nèi)部沒有二硫鍵，帶負電荷氨基酸（Asp＋Glu）總數(shù)為6個，帶正電荷氨基酸（Arg＋Lys）總數(shù)為6個，總體電荷分布情況為：000000-00-00＋00-＋00000＋00000＋-00-000000＋-＋0000。該蛋白質(zhì)等電點為7.38，分子質(zhì)量為5 363.1u（5.363ku）。

表1 CGA-N46氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of CGA-N46

分析CGA-N46的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為75.91，為不穩(wěn)定蛋白。蛋白質(zhì)疏水性的預(yù)測在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中不可缺少，一般根據(jù)該蛋白質(zhì)的GRAVY值來預(yù)測。GRAVY值的范圍在2與-2之間，負數(shù)表示該蛋白質(zhì)為親水蛋白，正數(shù)表示該蛋白質(zhì)為疏水蛋白。CGA-N46總平均親水性為-0.674，因而為親水蛋白。軟件分析得知，CGAN46在哺乳動物、酵母中的半衰期都大于20h。

2.2 CGA-N46的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用 GOR4、SIMPA96方法綜合觀測CGAN46的二級結(jié)構(gòu)，分析可知，在CGA-N46的二級結(jié)構(gòu)中，α螺旋占總體二級結(jié)構(gòu)的80.43%，無規(guī)則卷曲占總體二級結(jié)構(gòu)的19.57%，因此，CGA-N46總體呈現(xiàn)α螺旋形式。其二級結(jié)構(gòu)預(yù)測如圖1所示。

圖1 CGA-N46二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.1 Secondary structure prediction of CGA-N46

2.3 CGA-N46的跨膜區(qū)和信號肽預(yù)測

利用SWISS-PROT的跨膜蛋白數(shù)據(jù)庫Tmbase的分析工具TM pred分析CGA-N46氨基酸序列，預(yù)測CGA-N46的跨膜結(jié)構(gòu)。預(yù)測結(jié)果表明，CGAN46沒有跨膜的可能性，即沒有跨膜區(qū)。利用SignalP-NN軟件預(yù)測CGA-N46的信號肽序列，分析顯示該蛋白質(zhì)沒有信號肽?？缒^(qū)和信號肽預(yù)測結(jié)果表明，CGA-N46是位于細胞質(zhì)中的胞漿蛋白。

2.4 CGA-N46在細胞內(nèi)的定位

預(yù)測結(jié)果再現(xiàn)了該蛋白的信號肽序列、核定位信號、跨膜區(qū)定位、信號序列識別、線粒體定位信號、膜拓撲結(jié)構(gòu)等信息，結(jié)果表明CGA-N46進入細胞之后主要分布于細胞核（52.2%），其他的依次為細胞 質(zhì) （26.1%）、細 胞 骨 架 （17.4%）和 線 粒 體（4.3%）。

2.5 CGA-N46糖基化位點和磷酸化位點預(yù)測

蛋白質(zhì)糖基化（O-Glycosylated）對蛋白質(zhì)功能具有重要影響，如許多重要的細胞表面蛋白、識別蛋白和分泌蛋白都帶有一個或數(shù)個糖基。利用NetO-Glyc 3.1Server軟件分析CGA-N46糖基化位點。預(yù)測結(jié)果表明，CGA-N46沒有糖基化位點。

磷酸化（phosphorylation）是蛋白質(zhì)翻譯后廣泛存在的一種化學(xué)修飾，是調(diào)節(jié)酶或蛋白質(zhì)活性的重要步驟。利用 http：／／www.cbs.dtu.dk／services／NetPhos／網(wǎng)站的 NetPhos 2.0Server軟件分析CGA-N46磷酸化位點，結(jié)果如表2所示。預(yù)測結(jié)果表明，CGA-N46有2個磷酸化位點，分別位于第5位絲氨酸和第11位的蘇氨酸。

表2 CGA-N46磷酸化位點預(yù)測Table 2 Phosphorylation site prediction of CGA-N46

2.6 CGA-N46三維空間結(jié)構(gòu)

利用SWISS-Model程序預(yù)測CGA-N46的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果在PDB數(shù)據(jù)庫中沒有找到有效的模板，表明對該類蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的研究不多。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，動物抗菌肽多為帶陽離子電荷兩親α-螺旋構(gòu)型的多肽，其電荷特性便于其與負電荷的細胞膜表面相互作用，通過毯式模型或孔洞模型殺死真菌［9］。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CGA-N46雖然屬于α螺旋構(gòu)型的多肽，但與常見抗菌肽不同，CGA-N46呈電中性，等電點7.38，不能采用等電點為4.62的cathelicidins家族蛋白的作用機制［10］，從帶負電的脂多糖位置處轉(zhuǎn)移陰離子，使細胞壁發(fā)生紊亂，或與細胞壁表面帶負電荷的磷壁酸通過靜電引力結(jié)合，使抗菌肽穿過細胞壁靠近細胞質(zhì)膜，對細胞質(zhì)膜起作用。也不能通過靜電引力結(jié)合在帶負電荷的磷脂雙分子膜上，形成柵欄模型、毯式模型或膠束狀結(jié)構(gòu)，破壞細胞膜或細胞器生物膜達到抗菌的目的［11］。CGA-N46甘氨酸、脯氨酸含量低，也不會像脯氨酸含量高達33%的抗菌肽apidaecin與一種或幾種和蛋白合成相關(guān)的成分結(jié)合并發(fā)揮作用，起到殺菌效果［12］。

CGA-N46為親水性、α螺旋，含有一個半胱氨酸，可能會通過形成分子間二硫鍵，如抗菌肽β-defensin-3［13］，通過抑制細菌或真菌細胞壁的形成，使細菌或真菌不能維持正常的細胞形態(tài)而使其生長受阻，并導(dǎo)致細胞壁穿孔，最終殺死細菌或真菌。CGA-N46沒有跨膜區(qū)，為胞漿蛋白。因此，CGAN46可能在細胞內(nèi)存在靶位點，作用于細胞內(nèi)某些生物分子，通過影響其結(jié)構(gòu)與功能而起到殺菌作用。

近幾十年來，真菌感染現(xiàn)象已是非常普遍，免疫缺陷病人更甚，其感染真菌的病死率逐年上升。而當(dāng)前，耐藥性是真菌感染性疾病治療面臨的一個重要問題，即多數(shù)患者對常規(guī)的抗生素產(chǎn)生了耐藥性［14］。因此，尋找效性好、風(fēng)險性低的新型抗生素刻不容緩。抗菌肽采用不同的機制殺死真菌而不引起菌體產(chǎn)生耐藥性，被認為是傳統(tǒng)抗生素的最優(yōu)替代品［15］。CGA-N46是一種新型抗菌肽，其抗真菌作用機制也許不止上述預(yù)測的幾個方面。因此，闡明CGA-N46的作用機制還需要通過同位素標(biāo)記、基因缺失等實驗手段，并結(jié)合先進的生物物理儀器進行分析研究。同時，CGA-N46的其他生物學(xué)活性還有待進一步深入研究。

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