姜 曼，陶振強(qiáng)，蔣庭佳，賈南南，郭漢明

（上海理工大學(xué) 光電信息與計(jì)算機(jī)工程學(xué)院，上海 200093）

引 言

激光共焦掃描顯微鏡（LCSM）廣泛應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)等領(lǐng)域［1］，因其具有三維成像能力和良好的橫向分辨率和縱向分辨率［2－4］受到了廣泛的關(guān)注。傳統(tǒng)的掃描共焦顯微鏡，一般采用光束掃描式［5］，利用兩個(gè)相互垂直的平面掃描振鏡實(shí)現(xiàn)光學(xué)切片二維掃描［6］；然而，對(duì)于超大視場(chǎng)的成像，光束掃描方式由于在掃描過程中使光束發(fā)生偏轉(zhuǎn)，會(huì)在視場(chǎng)邊緣產(chǎn)生球差，引起視場(chǎng)邊緣成像與中心成像分辨率的不一致，從而容易導(dǎo)致光斑的空間輪廓形狀凹凸不平［7］。近年來，提出了一種采用數(shù)字微鏡器件的并行共焦檢測(cè)系統(tǒng)［8－10］提高成像速度的方法，但是在微透鏡陣列焦平面上得到的焦點(diǎn)是非均勻分布的，產(chǎn)生了一些畸變，與理想的焦點(diǎn)發(fā)生了位移。因此，采用工作臺(tái)運(yùn)動(dòng)實(shí)現(xiàn)掃描，即激發(fā)光的會(huì)聚焦點(diǎn)靜止而載物臺(tái)進(jìn)行二維或三維運(yùn)動(dòng)實(shí)現(xiàn)連續(xù)掃描。這種工作臺(tái)運(yùn)動(dòng)掃描方式，優(yōu)點(diǎn)是在對(duì)超大視場(chǎng)的逐點(diǎn)掃描成像時(shí)，可以在整個(gè)視場(chǎng)區(qū)域?qū)崿F(xiàn)一致的高分辨率成像，缺點(diǎn)則是成像速度慢。

為了提高成像速度，本文對(duì)工作臺(tái)運(yùn)動(dòng)掃描方式LCSM中傳統(tǒng)的多幀取平均的方法進(jìn)行了改進(jìn)，設(shè)計(jì)并實(shí)現(xiàn)了一種基于工作臺(tái)連續(xù)運(yùn)動(dòng)的LCSM系統(tǒng)，并且提出了單幀成像濾除隨機(jī)噪聲的方法。

圖1 系統(tǒng)原理Fig.1 Principle diagram of the system

1 反射式LCSM的工作原理

圖1是設(shè)計(jì)的反射式LCSM系統(tǒng)原理圖，該系統(tǒng)主要由幾大模塊組成，包括：光學(xué)成像模塊、光電轉(zhuǎn)換及放大模塊、機(jī)械掃描模塊、數(shù)據(jù)采集及數(shù)據(jù)處理模塊。

其中光學(xué)成像模塊采用無限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)，由于其系統(tǒng)中存在一段平行光路，在光學(xué)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和像差矯正上具有一定的優(yōu)勢(shì)。入射光波為405nm的激光，該波長(zhǎng)不僅不會(huì)殺傷細(xì)胞，而且滿足高分辨率的要求。采用共軛技術(shù)成像，使光源、被測(cè)樣品及探測(cè)器處于彼此對(duì)應(yīng)的共軛位置上。入射激光經(jīng)過分光鏡反射后聚焦到樣品的某點(diǎn)處，由該點(diǎn)激發(fā)出來的熒光透過顯微物鏡，光束經(jīng)過分光鏡與高通濾波器后，僅有熒光波段通過，熒光通過成像透鏡聚焦于針孔處，非焦平面上的雜散光被濾掉，通過針孔的熒光被光電倍增管接收，工作臺(tái)通過作三維掃描便可以完成對(duì)光學(xué)斷層成像。

2 影響LCSM分辨率的因素

2.1 針孔大小及取樣間隔的選擇

針孔的大小與愛里斑的直徑相關(guān)，許多人對(duì)LCSM的三維光學(xué)傳遞函數(shù)與探測(cè)器前方針孔直徑之間的關(guān)系進(jìn)行了研究［11－12］。結(jié)果表明［11］，該針孔直徑不必非常小。當(dāng)針孔直徑恰好等于一個(gè)愛里斑所成像的大小時(shí)，探測(cè)器接收到的光能量較高，既可以提高信噪比，又不會(huì)對(duì)分辨率造成特別大的影響。愛里斑經(jīng)過無限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)放大后，其像的大小為：

其中，β為系統(tǒng)的放大倍率，λ為入射光波長(zhǎng)，NA為數(shù)值孔徑。已知β＝40倍，λ＝405nm，NA＝0.95，根據(jù)式（1）計(jì)算得到愛里斑像的大小約為20μm。因此，該系統(tǒng)選用20μm針孔直徑。取樣間隔遵循的原理是奈奎斯特采樣定理，將愛里斑作為周期信號(hào)，能夠區(qū)分兩個(gè)愛里斑的取樣間隔為0.25個(gè)愛里斑直徑，將取樣間隔定位在100～125nm之間，即可滿足還原高分辨率圖像的要求。

2.2 數(shù)據(jù)分配消除隨機(jī)噪聲

隨機(jī)噪聲具有很寬的頻譜，若采用低通濾波，必然會(huì)造成圖像的高頻成分損失。傳統(tǒng)的做法是多幀平均，根據(jù)隨機(jī)噪聲互不相關(guān)的特點(diǎn)，且均值為零，可以有效的壓縮噪聲。具體的方法就是在被測(cè)實(shí)驗(yàn)樣本熒光極弱的情況下可通過多幀平均的方法來提高信噪比。盡管納米位移臺(tái)的重復(fù)精度很高（小于5nm），但是多幀平均會(huì)使掃描時(shí)間成倍增加，為了在一次掃描時(shí)間內(nèi)完成濾除隨機(jī)噪聲的任務(wù)，提出了利用數(shù)據(jù)分配濾除隨機(jī)噪聲的方法，即在每一點(diǎn)附近采集多次，再將這些值累加或加權(quán)取平均得到該點(diǎn)的能量值。具體原理如下所述。

在任意時(shí)刻采集的數(shù)據(jù)為：

輸入數(shù)據(jù)的噪聲功率：σ2

在某一段時(shí)間內(nèi)，采集到的數(shù)據(jù)為：

當(dāng)采集卡的采樣率S→＋∞，且K為有限值時(shí)，t→0，相當(dāng)在極短的時(shí)間內(nèi)在某一點(diǎn)處取了K次，此時(shí)，輸出數(shù)據(jù)可以近似表示為：

噪聲的均值和方差分別為：

信噪比：

累加后的信噪比提高了K倍。

采集卡的型號(hào)是 NI－6120（12bit），采樣率單位為S／s，表示每秒鐘采集的次數(shù)。最高采樣率可以達(dá)到10 000 000S／s。當(dāng)采樣率足夠高時(shí)，可以近似認(rèn)為在一點(diǎn)處取得的平均值，就每一行而言，具體采集方法如圖2所示。

若采集范圍為50μm，需要500個(gè)像素，工作臺(tái)掃描速度為100μm／s，當(dāng)采樣率設(shè)置為1 000 000S／s時(shí)，每行可以得到500 000個(gè)點(diǎn)，取樣間隔為100nm，每個(gè)間隔內(nèi)有1 000個(gè)采集點(diǎn)可供分配，若將1 000個(gè)采集點(diǎn)都取平均，相當(dāng)于低通濾波器掩膜尺寸太大，導(dǎo)致細(xì)節(jié)被濾掉，圖像變得很平滑。為了避免這種情況，只取其中的前十分之一的數(shù)據(jù)，即100個(gè)采集點(diǎn)做加權(quán)平均，這100個(gè)采集點(diǎn)分布在10nm范圍內(nèi)，對(duì)分辨率不會(huì)造成影響。

圖2 采集方法Fig.2 Acquisition method

圖3 不同采樣率對(duì)比Fig.3 Comparison of different sampling rate

如圖3所示，兩幅圖均取了50次平均，圖3（a）的采樣率為10 000S／s；圖3（b）的采樣率為100 000S／s可以看出隨著采樣率的提高，平滑效果減弱。事實(shí)上，當(dāng)采樣率可以設(shè)置為10 000 000S／s時(shí)，取樣平均的次數(shù)也可以增加，使均值趨于零。利用這種方法有效地濾掉了隨機(jī)噪聲，同時(shí)還保留了圖像細(xì)節(jié)。

3 同步系統(tǒng)設(shè)計(jì)

3.1 同步采集方法研究

該系統(tǒng)選用PI公司的3軸壓電陶瓷驅(qū)動(dòng)納米位移臺(tái)，型號(hào)是P－545，3個(gè)軸移動(dòng)范圍均為200μm，由于具有長(zhǎng)量程和型面不高的特點(diǎn)，非常容易整合進(jìn)高分辨率的顯微鏡內(nèi)，并且位移精度可以達(dá)到1nm，完全滿足高分辨成像的需要。

圖4 單向掃描Fig.4 The single－direction scanning

連續(xù)掃描是指工作臺(tái)可以從初始位置連續(xù)移動(dòng)到目標(biāo)位置，同時(shí)采集卡不間斷的采集數(shù)據(jù)，因此，工作臺(tái)與采集卡實(shí)現(xiàn)同步尤為重要。工作臺(tái)P－545的單向重復(fù)性優(yōu)于雙向。因此，采用如圖4所示的單向梳狀掃描路徑，并以100μm／s的速度運(yùn)動(dòng)的，在這個(gè)速度下運(yùn)動(dòng)，工作臺(tái)狀態(tài)比較穩(wěn)定。

采集卡需要工作在有限連續(xù)采集模式下，具體方法：給每一行分配一個(gè)指定大小的緩存區(qū)，當(dāng)工作臺(tái)運(yùn)動(dòng)到每一行的目標(biāo)位置時(shí)，恰好使采集到的數(shù)據(jù)填滿緩存區(qū)，讀取后清空緩存區(qū)；工作臺(tái)沿縱向只移動(dòng)步距，不采集數(shù)據(jù)。每行采集均重復(fù)此過程，采集卡在該模式下工作，沒有任何數(shù)據(jù)被覆蓋掉。除此之外，為了實(shí)現(xiàn)工作臺(tái)運(yùn)動(dòng)與數(shù)據(jù)采集同步，還需將工作臺(tái)與采集卡參數(shù)匹配設(shè)置，表1列舉了一些工作臺(tái)與采集卡設(shè)置的參數(shù)，根據(jù)不同的需求，選擇合適的掃描范圍。其中，掃描范圍、掃描速度與像素?cái)?shù)目決定了成像時(shí)間，掃描范圍與像素?cái)?shù)目決定了取樣間隔，繼而影響了分辨率，表1給出的參數(shù)滿足實(shí)現(xiàn)高分辨率成像的要求。根據(jù)實(shí)際情況對(duì)分辨率的不同要求，調(diào)整表中的參數(shù)，在相同掃描范圍與像素?cái)?shù)目下，采樣率越高，賦值范圍越小，去噪效果越好。

表1 同步參數(shù)設(shè)置Tab.1 Synchronous parameter setting

3.2 系統(tǒng)軟件設(shè)計(jì)

圖5為數(shù)據(jù)同步采集模塊的軟件設(shè)計(jì)流程圖。首先，設(shè)置工作臺(tái)掃描速度與掃描范圍；然后，設(shè)置采樣率，使采樣率、掃描速度和掃描范圍完全匹配，即保證工作臺(tái)運(yùn)動(dòng)到目標(biāo)位置時(shí)，采集卡緩存區(qū)剛好被填滿，其中，循環(huán)次數(shù)由像素?cái)?shù)決定。

操作控制界面如圖6所示，主要包括光源控制模塊、采集參數(shù)設(shè)置、工作臺(tái)控制器參數(shù)設(shè)置、實(shí)時(shí)顯示模塊。

圖5 數(shù)據(jù)同步采集模塊流程圖Fig.5 Flow chart of synchronous data acquisition

圖6 系統(tǒng)控制界面Fig.6 Software interface window of the system

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本文所研究的顯微鏡實(shí)驗(yàn)裝置如圖7所示，鑒于穩(wěn)定性的要求，加工了三維支架，保證了絕對(duì)水平和垂直。為了方便尋找細(xì)胞，將分光鏡分離的另一束光成像在CCD上，并且在工作臺(tái)下方安裝了粗調(diào)X，Y兩個(gè)方向的底座。

實(shí)驗(yàn)中所采用的樣品是老鼠腦細(xì)胞，細(xì)胞的平均尺寸約為10μm。將表1中的參數(shù)輸入軟件中，完成圖像掃描，可獲得如圖8（b）所示的共焦掃描圖像，并與蔡司寬場(chǎng)顯微鏡對(duì)該細(xì)胞拍攝的圖像進(jìn)行對(duì)比，如圖8（a）所示，可以看出寬敞顯微鏡只能看到細(xì)胞的輪廓，而我們研制的共焦顯微鏡可分辨的細(xì)節(jié)在400nm左右 。

圖7 實(shí)驗(yàn)裝置Fig.7 Experiment device

圖8 對(duì)比結(jié)果Fig.8 Comparision of results

5 結(jié) 論

本文研制的基于工作臺(tái)連續(xù)運(yùn)動(dòng)的LCSM系統(tǒng)，完成了系統(tǒng)控制和數(shù)據(jù)采集的任務(wù)，利用有限連續(xù)采集模式，解決了機(jī)械控制與數(shù)據(jù)采集難以同步的問題，并在此基礎(chǔ)上完成了軟件系統(tǒng)的開發(fā)工作。與傳統(tǒng)的多幀取平均掃描方式相比，大大地提高了成像速度。本文所述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是在納米位移臺(tái)單向掃描方式下獲得的，若納米位移臺(tái)雙向重復(fù)性好，能夠?qū)崿F(xiàn)雙向掃描，還可以進(jìn)一步提高成像速度。

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