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豬TREM-1基因的克隆與啟動(dòng)子分析

2013-08-15 00:45:28應(yīng)詩家施振旦
關(guān)鍵詞:內(nèi)含子堿基外顯子

李 輝,應(yīng)詩家,施振旦

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所,江蘇 南京 210014)

髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體1(Triggering receptor expressed on myeloid cells 1,TREM-1)是2000年發(fā)現(xiàn)的一種新型免疫球蛋白超家族成員,分子量約為30000,主要分布在外周血中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞亞群等天然免疫反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞和肺泡吞噬細(xì)胞等細(xì)胞表面[1]。研究表明,TREM-1受體在炎癥反應(yīng)中起著重要作用[2-3],適度表達(dá)有助于加速機(jī)體對(duì)病原體的清除,過度表達(dá)則使TREM-1與其下游細(xì)胞因子形成正反饋?zhàn)苑置谡{(diào)節(jié)回路,促使炎癥反應(yīng)增強(qiáng)放大,導(dǎo)致過度的炎癥反應(yīng)[4-7],最終引起機(jī)體細(xì)胞損傷和多臟器功能衰竭,嚴(yán)重時(shí)將危及動(dòng)物的生命。因此TREM-1被認(rèn)為是整個(gè)炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵觸發(fā)節(jié)點(diǎn)[8]。而通過降低TREM-1基因的表達(dá)或阻斷其信號(hào)傳導(dǎo)通路,可有效改變炎癥發(fā)生的規(guī)律,抑制炎癥過度反應(yīng)的發(fā)生,提高被感染動(dòng)物的生存率[9-10]。

TREM-1基因自發(fā)現(xiàn)后,多集中于人和小鼠炎癥相關(guān)領(lǐng)域的研究上,在家畜上的研究較少,目前只在牛[11]、水牛[12]和豬[13]上有報(bào)道。對(duì)于豬的TREM-1基因,GenBank僅收錄了3條 mRNA(CDS)序列(登錄號(hào)分別為:AY382477、AY382476和NM213756),而沒有包含啟動(dòng)子在內(nèi)的全基因序列的資料。重要信息的缺乏,造成人們對(duì)其結(jié)構(gòu)(例如:外顯子和內(nèi)含子的數(shù)目、長度以及啟動(dòng)子序列的長度、重要順式作用元件的數(shù)量和堿基構(gòu)成等)了解較少,也因此阻礙了對(duì)該基因的進(jìn)一步研究?;谏鲜鰡栴},本試驗(yàn)擬利用Genome walking技術(shù)克隆豬TREM-1基因包括啟動(dòng)子在內(nèi)的全部DNA序列,并對(duì)該基因的結(jié)構(gòu)和啟動(dòng)子序列進(jìn)行詳細(xì)生物信息學(xué)分析,旨在為豬TREM-1基因功能的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及材料

DNA genome walking kit、LA-Taq高保真DNA聚合酶、pMD18-T克隆載體購自大連TaKaRa公司,DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自南京鼎國生物技術(shù)有限公司,DNA凝膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司,豬基因組DNA由本實(shí)驗(yàn)室凍存。試驗(yàn)所用引物由Invitrogen公司合成,其他均為常規(guī)試劑。

1.2 方法

1.2.1 豬TREM-1基因全序列的Genome walking PCR 根據(jù)GenBank收錄的豬TREM-1基因mRNA序列(登錄號(hào):NM213756),在3'端下游設(shè)計(jì)3條特異性引物,分別命名為SP1、SP2和SP3。根據(jù)DNA genome walking kit中所提供的隨機(jī)引物(AP),以豬基因組DNA為模板,依次用引物SP1、SP2和SP3,按照試劑盒說明書推薦的反應(yīng)程序進(jìn)行3次交錯(cuò)式熱不對(duì)稱PCR反應(yīng)(特異性引物的設(shè)計(jì)原則及詳細(xì)的PCR操作過程按DNA genome walking kit說明書進(jìn)行)。最后將3次PCR產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。如果Genome walking PCR成功,以SP3為引物的PCR會(huì)有特異擴(kuò)增產(chǎn)物。電泳檢測(cè)時(shí),所對(duì)應(yīng)的泳道在紫外燈下可觀察到特異條帶。將特異條帶切膠純化回收后接入pMD18-T克隆載體,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑取陽性克隆送生物公司進(jìn)行測(cè)序,然后對(duì)獲得的DNA序列進(jìn)行比對(duì)分析。確定序列正確后,以測(cè)序獲得的DNA序列為模板,在其5'端上游重新設(shè)計(jì)3條特異性引物,進(jìn)行下一輪的熱不對(duì)稱PCR反應(yīng),向未知序列區(qū)延伸,操作過程同上。直至最終獲得豬TREM-1基因及其啟動(dòng)子的全序列。

1.2.2 豬TREM-1基因的拼接比對(duì)及啟動(dòng)子區(qū)序列的分析所獲得的全部DNA序列測(cè)序正確后,利用DNAStar、Bioedit7.0等軟件進(jìn)行拼接。拼接后的DNA序列與GenBank收錄的登錄號(hào)為NM213756的序列利用Aligen(bl2seq)進(jìn)行雙序列比對(duì)分析,獲得外顯子和內(nèi)含子的數(shù)量、界限和長度。利用在線啟動(dòng)子分析軟件Alibaba2.1(www.gene-regulation.com/pub/programs/html#alibaba2.1),對(duì)獲得的豬TREM-1基因啟動(dòng)子區(qū)序列進(jìn)行預(yù)測(cè),分析啟動(dòng)子內(nèi)調(diào)控其轉(zhuǎn)錄的重要順式作用元件的位置、數(shù)量及堿基構(gòu)成。

2 結(jié)果

2.1 豬TREM-1基因序列的拼接和比對(duì)

經(jīng)過多輪熱不對(duì)稱PCR反應(yīng),回收特異性條帶并測(cè)序后,將所得DNA序列拼接,獲得了包括啟動(dòng)子序列在內(nèi)的豬TREM-1基因共32414 bp。將拼接序列與GenBank中收錄的mRNA序列(NM213756)進(jìn)行Aligen比對(duì)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),其啟動(dòng)子區(qū)長度為10863 bp(1~10863),結(jié)構(gòu)基因長度為 21551 bp(10864~32314),轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為第10864堿基。并且發(fā)現(xiàn)該基因由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成。其中第一外顯子長度為108 bp(10864~10971),主要為編碼信號(hào)肽的序列,翻譯起始密碼子(ATG)位于第10923堿基處。第一內(nèi)含子長度為12550 bp(10972~23521),第二外顯子長度為357 bp(23522~23878),第二內(nèi)含子長度為1347 bp(23879~25125),第三外顯子長度為204 bp(25126~25330),第三內(nèi)含子長度為 6713 bp(25331~32043),第四外顯子長度為 371 bp(32044~32414)。終止密碼子和PloyA加尾信號(hào)序列分別位于第32044堿基和第32394堿基處。目前已將克隆所得的全基因序列提交至GenBank,分配的登錄號(hào)為KC688694。

2.2 豬TREM-1基因啟動(dòng)子序列分析

通過在線啟動(dòng)子分析軟件Alibaba2.1分析發(fā)現(xiàn),在豬TREM-1基因啟動(dòng)子序列中,與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的重要順式作用元件大部分分布于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游5000 bp的范圍內(nèi)。該區(qū)域中含有典型的TATA框(TATATATT),位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-681 bp處。同時(shí)發(fā)現(xiàn)多個(gè)與維持啟動(dòng)子基本轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)的順式作用元件,如Sp-1(7個(gè))、C/EBP(4個(gè))以及NF-1(4個(gè))等。而且上述各元件均坐落于鄰近TATA框的區(qū)域,位置的鄰近可能更方便轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的組裝和轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)。另外還發(fā)現(xiàn)應(yīng)答LPS刺激和調(diào)控TREM-1基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),例如:NF-κB(5個(gè))、Ap-1(4個(gè))以及PU-1(1個(gè))等因子。3種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)集中于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游 -1600~-4500 bp的區(qū)域。

3 討論

本研究首次克隆并注釋了豬TREM-1基因的全基因組序列,對(duì)該基因的結(jié)構(gòu)有了較深入的了解。并對(duì)啟動(dòng)子區(qū)的重要轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析。在啟動(dòng)子序列中找到了與調(diào)控TREM-1基因表達(dá)相關(guān)的NF-κB、Ap-1和PU-1等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。在TREM-1基因表達(dá)中,NF-κB是其中最重要的轉(zhuǎn)錄因子,LPS與胞外受體結(jié)合后,經(jīng)過一系列反應(yīng),最終引起抑制狀態(tài)的IκB的磷酸化,磷酸化后成為具有活性的NF-κB,并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中,與TREM-1基因啟動(dòng)子序列中的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合,促進(jìn) TREM-1基因的表達(dá)[14-17]。目前在小鼠TREM-1基因啟動(dòng)子的研究中發(fā)現(xiàn)3個(gè)NF-κB結(jié)合位點(diǎn)。受到LPS刺激時(shí),最末端的結(jié)合位點(diǎn)在提高TREM-1基因表達(dá)的過程中起主要作用[18]。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在LPS刺激時(shí),AP-1可與c-cos/c-jun協(xié)同作用共同促進(jìn)TREM-1的表達(dá)[18],而PU-1則在負(fù)調(diào)控TREM-1基因表達(dá)方面有著不可替代的作用[19-21]。受到LPS刺激后,NF-κB和AP-1會(huì)迅速結(jié)合到TREM-1基因啟動(dòng)子上,并啟動(dòng)表達(dá)。但是PU-1的結(jié)合較慢(約15 min后才開始結(jié)合)[20]。在本研究中,雖然已通過分析獲得了重要轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn),但仍須進(jìn)一步驗(yàn)證。

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