宋尚偉　張恒濤等

摘 要： 【目的】開發(fā)蘋果 EST-SSR 引物，評價蘋果種質(zhì)資源的多樣性與親緣關系?！痉椒ā坷?NCBI數(shù)據(jù)庫中蘋果 EST 的 SSR 位點開發(fā)了 35 對 EST-SSR 引物，建立了蘋果 EST-SSR 體系，并利用篩選出的 16 對引物對蘋果品種資源的親緣關系進行研究。【結(jié)果】118 份基因組 DNA 共擴增出等位基因位點 138 個，位點數(shù)的變化從 3 到 13 不等，平均每對引物檢測到 8.62 個位點，總的多態(tài)性比率為94.2%，各引物的多態(tài)性比例分布為 81.8%～100%，相似系數(shù)為 0.48～1.00。利用 UPGMA 法構(gòu)建聚類樹狀圖，在相似性系數(shù) 0.65 處可將 118 個供試材料分為5大組：其中第1組又可分為2個亞組，包含了絕大部分供試材料；第2、3、4和5組包含的品種數(shù)目分別為 12 個、11 個、3 個和 2 個；第5組與其他組親緣關系較遠，相似性系數(shù)僅為 0.48?！窘Y(jié)論】篩選出的 16 對 EST-SSR 引物可用于評價蘋果種質(zhì)資源間的遺傳多樣性。

關鍵詞： 蘋果； EST-SSR 引物； 親緣關系； 聚類分析； 相似性系數(shù)

中圖分類號：S661.1 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪04-0509-07

蘋果屬（Malus Mill.）植物種類繁多，分布廣泛，多具有較高的經(jīng)濟價值。之前，分類學家從形態(tài)學、細胞學、孢粉學、同工酶等方面對蘋果的親緣演化關系進行研究并取得一定進展[1-3]。但傳統(tǒng)方法對于差異不明顯的形態(tài)有時難以識別，一些特征易受生態(tài)環(huán)境的影響，SSR 標記多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性突出，在蘋果及近緣種質(zhì)鑒別與親緣關系研究中也已得到應用[4-6]。但開發(fā) SSR 標記過程繁瑣，成本較高，是其應用的主要限制因素[7]。EST-SSR 標記具有開發(fā)效率高、成本低的特點，是 SSR 標記的重要來源[8]，因其來自基因編碼區(qū)，更易獲得基因表達的信息，目前已經(jīng)應用在葡萄[9]、甘蔗[10]、小麥[11]、大麥[12]、大豆[13]、水稻[14]等物種的遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建和系統(tǒng)演化研究等領域。近年來，隨著蘋果屬 EST 庫數(shù)據(jù)資源不斷豐富，開發(fā) EST-SSR 標記已具備了基礎，姚利華等[15]用開發(fā)出的12 對 EST-SSR 引物對 20 個蘋果品種的多樣性進行了檢測，Gasic 等[16]對蘋果EST-SSR 在其他薔薇科植物上的應用進行了研究。我們擬利用數(shù)據(jù)庫資源開發(fā)新的 EST-SSR 標記，對 118 份蘋果種質(zhì)進行親緣關系分析，以豐富該類標記資源，并對育種中品種資源的評估、篩選與利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 EST-SSR 序列的查找 利用 SSR 鑒定軟件與網(wǎng)站在線搜索工具，從 GDR（http：//www.bioinfo.WSU.edu/gdr/）中搜索蘋果屬含有 SSR 的 EST 序列，并進行可利用性篩選，篩選序列長度不小于100 bp且不大于 700 bp 以及單至六堿基重復單元的重復次數(shù)至少為 10，6，5，5，5 和 5 的標準[9]。

1.2.2 EST-SSR 引物對的設計 應用引物設計軟件 Primer Premier 5.0 對符合條件的部分 EST-SSR 序列進行引物設計。設計 EST-SSR 引物的原則和參數(shù)為：避免二級結(jié)構(gòu)；引物長度一般控制在 18～22 bp；GC 含量在 40%～60%；理論退火溫度 （Tm） 在 55～60 ℃ ，且上下游引物Tm 值相差不超過 5 ℃；產(chǎn)物長度控制在 100～350 bp，以更加有效地擴增目標 SSR。引物委托上海生物工程技術服務有限公司合成。

1.2.3 基因組 DNA 提取及檢測 采用改良的 CTAB 法[17]提取蘋果葉片總 DNA。獲得的 DNA 經(jīng)紫外分光光度計檢測OD260/OD280 比值；用 0.8% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA 純度。將合格的基因組 DNA原液稀釋到 20 mg·L-1 于-20 ℃ 條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 SSR-PCR 擴增 PCR 擴增在 PTC-200PCR 儀上進行。通過優(yōu)化確定了穩(wěn)定的蘋果 EST-SSR 反應體系，即在 25 μL 體系中，MgCl2 濃度為 2.0 mmol·L-1，dNTPs 濃度為 0.3 mmol·L-1，TaqDNA聚合酶用量為 1.0 U，DNA 模板用量為 1.5 mg·L-1，引物濃度為0.4 μmol·L-1。擴增程序為： 94 ℃ 預變性5 min；94 ℃ 變性 45 s，52 ℃ 退火 45 s，72 ℃ 延伸1 min，進行30個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min；4 ℃ 保存。

1.2.5 擴增產(chǎn)物檢測及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 從供試材料隨機選取部分品種基因組 DNA 樣品，用不同引物在上述反應體系中將其擴增，聚丙烯酰胺凝膠電泳后以條帶的多態(tài)性和穩(wěn)定性為標準進行篩選。以選出的引物對各供試材料進行擴增，參照 Bassam 等[18]的銀染檢測方法進行檢測。

凝膠上相同遷移率的條帶假定來自同一等位基因，每個反應獨立進行2次，不統(tǒng)計不穩(wěn)定的條帶或弱帶。每對 EST-SSR 引物檢測 1 個位點，電泳圖譜的每條多態(tài)性帶均為一個分子標記，代表引物結(jié)合位點的一個等位基因。根據(jù)條帶的有無統(tǒng)計所有二元數(shù)據(jù)，有帶計為“1”，無帶計為“0”。所有引物對供試樣品的讀帶記錄結(jié)果形成 1-0 矩陣，相似性系數(shù)利用NTSYS-pc2.10e 軟件中的 Qualitative date 程序來計算，獲得相似系數(shù)矩陣；聚類分析用SHAN 程序和 UPGMA 方法進行，聚類圖通過 Tree plot 模塊生成。

2 結(jié)果與分析

2.1 EST-SSR 序列搜索結(jié)果

2.2 多態(tài)性 EST-SSR 引物的篩選

2.3 EST-SSR 擴增產(chǎn)物的多態(tài)性分析

2.4 相似性系數(shù)與聚類分析

在相似性系數(shù)為 0.65 處可將供試材料分為5個組，其中第1個組又可分為2個亞組，包含了絕大部分供試材料；第2個組有 12個品種（‘遼伏、‘首紅、‘禹冠、‘4354、‘華帥、‘早翠綠、‘哈蒂、‘5號紅星、‘美 2991、‘青香蕉、‘F4-4、‘禮泉短富）；第3個組有 11 個品種（‘理想、‘長富 2、‘哈麗、‘華紅、‘80NY、‘布瑞本、‘紅肉蘋果、‘1996-1-21、‘葵花、‘紅奧和‘國光）；第4個組僅有 3 個品種（‘皇家富士、‘紅王將和‘早富）；第5個組僅有 2 個品種（‘孟諾耶和‘艾達紅），相似性系數(shù)為 0.48，與其他品種親緣關系較遠。

3 討 論

與其他分子標記相比，EST-SSR 標記來自表達基因的全部或部分序列，其多態(tài)性可能直接與該基因功能相聯(lián)系。 研究發(fā)現(xiàn)，水稻的蠟質(zhì)基因 5 端非編碼區(qū)中的 SSR 序列（CT）n 長度變化不僅與直鏈淀粉的含量有關[18]。而且還決定了糯稻淀粉的理化特性[19]。因此根據(jù) EST 包含的 SSR 位點開發(fā)的分子標記，是直接與功能相關的功能標記[20]。EST-SSR 標記的這一特點決定了其在功能基因標記方面應用前景廣闊。

本試驗通過對蘋果 EST-SSR 引物的開發(fā)，篩選出 16 對多態(tài)性好，對蘋果品種的區(qū)分能力強的引物。運用 NTSYS-pc2.0e 軟件計算遺傳相似系數(shù)，118 份蘋果品種的相似系數(shù)為 0.48～1.00，說明供試的 118 份蘋果種質(zhì)資源間有較大的遺傳變異，遺傳多樣性較高。并根據(jù) 16 對 EST-SSR 引物的擴增結(jié)果，對 118 個蘋果品種進行了聚類分析，可以看出 ，同一個親本蘋果基本上都聚在一起，盡管所檢測的 SSR 位點較少，但結(jié)果表明，絕大部分系譜相同或相近的品種聚在一起，個別品種分布在其他組中，與 Hokanson 等[21]的研究結(jié)果相近。說明用 EST-SSR 標記對蘋果種質(zhì)資源進行分類是可行的。

根據(jù)本試驗聚類分析的結(jié)果，第2個組有 12 個品種（‘遼伏、‘首紅、‘禹冠、‘4354、‘華帥、‘早翠綠、‘哈蒂、‘5 號紅星、‘美2991、‘青香蕉、‘F4-4、‘禮泉短富）；在這些品種中，‘首紅、‘哈蒂、‘5 號紅星均為元帥系的芽變，因此在生物學特性上有很多相似之處。而‘華帥的雜交親本為‘富士和‘新紅星，‘華帥的果實外觀與‘元帥幾乎沒有差別。‘早翠綠與它們相比，同樣具有樹勢強健、樹冠緊湊、適合密植，果實圓錐或圓形，以短果枝結(jié)果為主，腋花芽形成能力強等特點[22-26]。第3個組 11 個品種中，‘長富 2 為‘富士的芽變品種，而‘富士為‘國光與‘元帥雜交的后代?！畤?、‘富士、‘長富 2、‘哈麗、‘葵花、‘布瑞本、‘紅奧這幾個品種都有樹勢強、果面底色淡黃色或黃綠色，果點小，果肉黃白色，肉質(zhì)細脆，汁多，酸甜適中等特點[22-25]。第4個組僅有 3 個品種，這3個品種均為富士系，‘皇家富士、‘早富為富士的不同芽變品種，其中‘紅王將為從高接的‘早生富士上發(fā)現(xiàn)的著色系芽變，風味、采收期、樹勢與‘早生富士相近或相同[22]。上述結(jié)果表明，基于 EST-SSR 標記的聚類分析結(jié)果與品種間的系譜關系和表型是吻合的，因而應用該技術對蘋果品種進行遺傳關系研究，能夠為種質(zhì)的評估、利用和改良提供依據(jù)。

部分品種 EST-SSR 標記聚類分析結(jié)果與系譜資料不盡一致，如未將富士系芽變品種聚類在一組；第5個組僅有 2 個品種，均為‘紅玉的雜種后代，親緣關系相近，但2者與其他品種親緣關系較遠，相似性系數(shù)為 0.48。出現(xiàn)上述結(jié)果可能的原因之一，至少一部分 SSR位點與重要的育種性狀連鎖不緊密，所受的選擇壓力小，造成相同或相似系譜分離后代中不同等位基因在分配上的隨機性；其二，即使選自同一組合的品種，由于選育過程中選擇標準不同，仍可能造成較大的遺傳差異，而這種差異無法反映在系譜資料中；第三，蘋果基因組龐大而結(jié)構(gòu)復雜，少量的 SSR 標記難以反映全部基因組所有區(qū)域上的遺傳差異情況。

4 結(jié) 論

利用蘋果 EST 數(shù)據(jù)庫開發(fā)了 16 對多態(tài)性豐富的 EST-SSR 引物，并用其對 118 份蘋果品種資源的親緣關系進行研究，共擴增出結(jié)合位點 138 個，總的多態(tài)性比率為 94.2%，供試材料相似系數(shù)的變化在 0.48～1.0，在相似性系數(shù) 0.65 處可將 118 份材料分為5組。研究表明篩選出的 16 對 EST-SSR 引物可用于評價蘋果種質(zhì)資源間的遺傳多樣性。

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