王玉蘭　魯振華等

摘 要： 【目的】研究半矮生型桃‘SD9238F-box基因的序列特征及F-box基因在新梢生長躍變期的表達與節(jié)間伸長的關系，為進一步研究該基因調控半矮生型桃植株生長的分子機制奠定基礎?！痉椒ā坷没蚩寺『蚏ACE技術獲得‘SD9238F-box基因的gDNA及cDNA序列，并分析該基因的序列特征。采用 qRT-PCR 分析該基因在新梢生長躍變期的表達水平?！窘Y果】獲得F-box基因gDNA全長3 650 bp，cDNA 全長1 936 bp， GeneBank登陸號為KF023192。該基因ORF長1 509 bp編碼502個氨基酸，蛋白質分子質量55.984 kD。生物信息學分析表明，氨基酸序列具有F-box蛋白家族中LRR的結構特征，與薔薇科中蘋果和草莓的F-box基因同源，相似性達98%。QRT-PCR分析結果表明，F(xiàn)-box基因在節(jié)間生長躍變期表達量的動態(tài)變化與新梢節(jié)間的伸長速率動態(tài)變化趨勢一致，其基因相對表達量在半矮生型桃中于節(jié)間生長躍變點5月22日達到最大值，為第一時期的9.4倍；在普通型桃中同樣于5月22日達到基因相對表達量的最大值，但只為第一時期的2.2倍?！窘Y論】獲得了‘SD9238新梢中F-box基因KF023192的序列全長，并明確了該基因的序列特征。對該基因在新梢生長過程的動態(tài)表達分析顯示，KF023192可能參與了半矮生桃新梢節(jié)間生長的調控。

關鍵詞： 半矮生型桃； ‘SD9238； F-box； 基因克隆； RACE； qRT-PcR

中圖分類號：S662.1 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪04-0543-08

F-box蛋白因最初發(fā)現(xiàn)于細胞周期蛋白Cyclin F中而得名[1]，它廣泛存在于真核生物中，擬南芥全基因組測序發(fā)現(xiàn)了1 000多個具有F-box結構域的蛋白[2]。它是一類含有F-box結構域的蛋白家族，基因大小為430～2 000 bp[3]。其N端通常含有一個由40～50個氨基酸組成的F-box基序，此外，在C端具有一些與蛋白-蛋白相互作用相關的二級結構，如亮氨酸拉鏈（LRR，Leucine-rich repeat）、WD-40 repeats、鋅指結構等，這些蛋白結構域介導了底物的特異性識別。F-box蛋白作為SCF復合體的重要組分，與植物的生長素、赤霉素、乙烯及茉莉酸等植物激素的信號傳導有關[4]。如植物中發(fā)現(xiàn)的F-box蛋白家族成員TIR1是SCF復合體組分，而SCF復合體SCFTIR通過參與生長素誘導的Aux/IAA蛋白降解，從而解除對ARF轉錄因子的抑制，進而調控植物的生長[5]。對擬南芥的GA不敏感型突變體gid2進行研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)-box蛋白SLR1可能通過依賴于GA的磷酸化作用經(jīng)SCF蛋白降解途徑正向調控GA的信號傳導[6]。此外，李莉等[7]通過對OsF-box基因的RNAi，利用表達載體轉化水稻‘日本晴研究該基因在水稻中的功能，結果顯示： 植株株高變矮，抽穗期延遲，但上部節(jié)間會繼續(xù)長出葉片和高位分蘗。以上研究表明，F(xiàn)-box蛋白參與了植物的激素信號傳導及形態(tài)建成等重要的生命活動，可能是調控植株生長的關鍵因子。

‘SD9238是中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所在育種圃雜種后代中發(fā)現(xiàn)的一個半矮生型桃突變體，其樹體相對矮小，萌芽率、成枝率較低[8]。該突變體樹體僅為普通型的1/2～1/3，節(jié)間較短，果枝粗壯而長度適中，年修剪量極小，是調控桃樹樹勢，實現(xiàn)樹體有限矮化的理想基因資源?！甋D9238早期生長緩慢，5月中旬開始進入快速生長期，與普通型桃同時期的持續(xù)快速生長截然不同。李鈺婷等[9]采用cDNA-AFLP技術在半矮生型桃‘SD9238的生長躍變期分離得到了F-box的差異表達序列，該基因可能參與了植株的生長調節(jié)。因此研究‘SD9238F-box基因的序列信息及表達特征，可為確定該基因在‘SD9238節(jié)間生長調控中的作用，并為進一步解析其調控半矮生型植株節(jié)間的生長機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

以中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所桃育種圃保存的7 a生半矮生型桃‘SD9238及普通型桃的實生苗為供試材料。取‘SD9238新生葉片，液氮速凍后保存于-80 ℃?zhèn)溆?；并?012年4月23日、5月6日、5月20日、5月22日、5月27日及6月8日取半矮及普通型桃當年生新梢莖尖，液氮速凍后保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 新生枝條生長動態(tài)測定

選取普通及‘SD9238各30個新生枝條為樣本，分別于新梢莖尖的取樣時期以及5月25日和6月12日，對新梢頂芽向下數(shù)第4節(jié)間進行節(jié)間長度測量，求平均值。

1.3 gDNA全長序列克隆

1.4 cDNA全長序列的克隆

桃莖尖總RNA的提取參考CTAB-LiCl法[11]，樣品檢測方法與gDNA相同。3′ RACE和5′ RACE cDNA的獲得采用SMARTERTM RACE cDNA Amplification Kit（Clontech），具體操作參照使用說明。其中5′ 端采用巢式擴增，以反轉錄獲得的cDNA第1條鏈為模板，在獲得片段的基礎上設計引物，與5′ RACE巢式通用引物（NUP）進行5′ cDNA末端2次擴增。5′ RACE和3′ RACE cDNA擴增PCR程序： 94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 40 s，30個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。目的片段的檢測、回收、克隆、測序及序列的峰圖矯正和拼接與gDNA中方法一致。

1.5 生長躍變期F-box基因的表達量分析

1.6 生物信息學分析

2 結果與分析

2.1 F-box基因結構及推導氨基酸序列分析

2.2 序列相似性及系統(tǒng)進化分析

2.3 生長躍變期F-box基因的表達特征

3 討 論

本研究根據(jù)GDR數(shù)據(jù)庫中桃基因組序列，對‘SD9238中的F-box基因KF023192進行了gDNA及cDNA序列的克隆。結果表明該序列與數(shù)據(jù)庫的序列一致，無變異位點。但通過克隆該基因的全長cDNA序列發(fā)現(xiàn)，其ORF與GDR數(shù)據(jù)庫中相比，5′ 端缺失681 bp（227個aa），沒有明顯的F-box結構域。序列比對結果表明該氨基酸序列與蓖麻、毛白楊以及葡萄等所獲得的F-box氨基酸序列相似度達64%～67%，序列覆蓋度達90%～100%。9個物種相似序列的系統(tǒng)發(fā)育樹表明該序列與蘋果中預測的F-box基因同源，相似達99%。同時氨基酸序列結構預測顯示，序列具有F-box家族蛋白的LRR結構特征。并有研究結果表明，某些F-box蛋白的功能不是通過F-box結構域而發(fā)生的，即不存在F-box結構域與Skp1的相互作用時，F(xiàn)-box蛋白仍具有功能。如F-box蛋白Rca1是細胞分裂后期促進復合體（anaphase promoting complex/cyclosome， APC/C）的重要抑制物，它能阻止未成熟周期蛋白的降解，但敲除F-box結構域后Rca1對APC/C依然具有抑制作用[13]，表明Rca參與該過程并非通過F-box結構域作用而發(fā)生。與GDR數(shù)據(jù)庫中生物信息學預測結果相比，本研究克隆所得F-box基因全長缺失681 bp，分析認為F-box家族蛋白的外顯子存在不同的剪接模式，或者是GDR數(shù)據(jù)庫中‘生物信息學的預測不準造成的，具體原因仍需進一步研究。

研究發(fā)現(xiàn)模式植物擬南芥中存在多種F-box蛋白，它們可能分別參與了信號傳導、激素（如乙烯、赤霉素等）代謝途徑以及生物鐘調節(jié)等生命活動。擬南芥中的F-box蛋白基因HWS的缺失將導致植株過量生長；而HWS基因過量表達時植株明顯矮小[14]，表明該基因對其生長與發(fā)育的調控有重要作用。水稻多蘗型矮稈突變體中分離到的D3基因，編碼的蛋白屬于F-box中LRR蛋白家族，基因表達分析結果表明該基因與細胞死亡相關[15]。除此以外，棉花、小麥以及蘋果上也有關于F-box基因的報道，分別與GA信號的傳導、花粉自交不親和有關[16]。對‘SD9238及普通型桃節(jié)間生長躍變期內F-box基因的表達特征分析表明，該基因表達水平的高低與節(jié)間生長快慢呈正相關，且‘SD9238中該基因表達量的增加倍數(shù)明顯大于普通型桃，證明F-box基因可能是參與‘SD9238節(jié)間生長調控的關鍵基因。

本研究克隆了半矮生型桃‘SD9238的F-box基因，并分析了該基因的序列特征，同時研究表明該基因是參與調控‘SD9238節(jié)間伸長的關鍵因子。但F-box基因如何調控半矮生型植株節(jié)間伸長，進而影響植株高度的分子機制仍需進一步研究。

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