吳石金，趙士良，沈飛超，徐 銘

（浙江工業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310032）

蚯蚓蛋白質(zhì)組雙向電泳技術(shù)體系的建立及條件優(yōu)化

吳石金，趙士良，沈飛超，徐 銘

（浙江工業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310032）

對赤子愛勝蚓（Eiseniafetida）表皮組織的兩種蛋白質(zhì)提取方法進行了比較，并對雙向電泳IPG膠條pH范圍，上樣量條件進行了優(yōu)化，結(jié)果表明：裂解液提取法提取的蛋白質(zhì)量濃度較低，蛋白種類缺失，采用TCA－丙酮沉淀法提取法，可顯著提高提取液蛋白質(zhì)提取效果，樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度可達12.49μg／μL.蚯蚓表皮組織蛋白質(zhì)主要分布在pH范圍4～7之間，適于選用24 cm pH 4～7線性梯度IPG膠條，采用考馬斯亮藍染色法時最適上樣量為600μg，所得電泳圖譜可檢測蛋白點達（629±20）個，且重復(fù)性實驗匹配率較高.用TCA－丙酮沉淀法提取蚯蚓表皮組織蛋白質(zhì)組，按優(yōu)化的參數(shù)進行雙向電泳分離，所得圖譜分辨率高、重復(fù)性好，可用于蚯蚓蛋白質(zhì)組學(xué)研究.

赤子愛勝蚓；蛋白質(zhì)組；TCA-丙酮；雙向電泳；條件優(yōu)化

蛋白質(zhì)組（proteome）是由 Wilkins和 Williams于1995年首次提出，并定義為“由基因組所表達的全部蛋白質(zhì)”［1］.雙向電泳（two-dimensional electro-phoresis，2-DE）是蛋白組學(xué)研究中的核心技術(shù)之一，原理是利用蛋白質(zhì)等電點（isoelectric points，p I）和分子量（molecular weight，MW）的不同將樣品蛋白質(zhì)組在二維平面上進行分開，是目前常用的一種能夠連續(xù)在一塊膠上分離數(shù)千種蛋白質(zhì)的方法［2］.利用雙向電泳技術(shù)對微生物和動植物全蛋白組進行分析，為毒理反應(yīng)提供蛋白質(zhì)水平理論依據(jù)的研究已非常廣泛，如李明云等［3］對低溫脅迫大黃魚（Pseudosciaenacrocea）肝組織損傷進行雙向電泳分析并找到了4個差異蛋白，陳國良等［4］建立了青楊（Populu）葉片雙向電泳技術(shù)體系并運用于鹽脅迫毒性研究.雙向電泳技術(shù)的關(guān)鍵是樣品制備，其決定了所得圖譜的分辨率和清晰度，樣品制備的目的是盡可能提取全部蛋白質(zhì)并防止其降解，同時除去樣品中非蛋白質(zhì)成分，減少對雙向電泳的干擾.生物組織成分復(fù)雜，且不同生物蛋白質(zhì)組差異較大，目前為止沒有一種通用的蛋白質(zhì)提取方式，因此需要根據(jù)研究對象組織特性進行方法篩選.此外，雙向電泳過程中IPG膠條pH范圍選擇、上樣量等技術(shù)條件，也對圖譜中蛋白點的信息量以及實驗重復(fù)性也有著巨大影響.

赤子愛勝蚓（Eiseniafetida）屬環(huán)節(jié)動物門寡毛綱（Oligochaeta），是土壤中生物量最大的無脊椎動物.蚯蚓對土壤中的污染物有著不同程度的反應(yīng)，首先表現(xiàn)為分子水平上的變化，進而影響到生存、生長和繁殖，甚至造成死亡.因此，以蚯蚓作為指示生物，通過分子生物學(xué)工具尋找污染標記物來診斷土壤污染生態(tài)毒理已成為研究熱點［5］.宋玉芳等［6］研究發(fā)現(xiàn)菲、芘單一與復(fù)合污染與蚯蚓致死率顯著相關(guān)，蚯蚓體內(nèi)細胞色素P45和金屬硫蛋白等也被研究發(fā)現(xiàn)可作為生物標志物蛋白運用于污染檢測［7］.為了進一步從蛋白質(zhì)組學(xué)水平上對蚯蚓進行生物毒理學(xué)研究，就需要建立適用于蚯蚓組織的雙向電泳技術(shù).蚯蚓表皮組織成分復(fù)雜，含有大量多糖，核酸，脂類和鹽離子等物質(zhì)，以及大量具有自我消化機制的蛋白水解酶［8］，使得蚯蚓的樣品制備具有特殊性和復(fù)雜性.筆者通過對蚯蚓表皮組織不同蛋白質(zhì)提取方法進行比較和加以改進，并對IPG膠條pH范圍以及雙向電泳上樣量進行優(yōu)化，建立具有高分辨率和重復(fù)性的蚯蚓雙向電泳技術(shù)體系，為后續(xù)的蚯蚓蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材 料

赤子愛勝蚓（Eiseniafetida）購于浙江省金華蚯蚓養(yǎng)殖公司.蚯蚓在拌有牛糞和自然土壤（浙江工業(yè)大學(xué)校園花圃采取并曬干處理）的培養(yǎng)箱內(nèi)，25℃恒溫培養(yǎng)，選取成年（頭部以下具具有明顯生殖環(huán)帶）并且體重、體長相近的蚯蚓作為實驗對象.

1.2 主要化學(xué)試劑和儀器設(shè)備

尿素、硫脲、甲叉丙烯酰胺、丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉（SDS）、3-［3-（膽酰胺基丙基）二甲氨基］丙磺酸鹽（CHAPS）、四甲基乙二胺（TEMED）、二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺、蛋白酶抑制劑（cocktail）及考馬斯亮藍為上海生工生物有限公司生產(chǎn)，三氯乙酸、丙酮和其他試劑為國產(chǎn)試劑.固相IPG膠條（pH 3～10，24 cm；pH 4～7，24 cm，均為線性pH梯度），載體兩性電解質(zhì)（Bio-lyte pH 3～10，pH 4～7）和上樣緩沖液試劑盒等為Bio-Rad公司生產(chǎn).所有溶液配制用水均由Millipore公司生產(chǎn)Mlilli－Q超純水儀提供.

雙向電泳系統(tǒng)，包括一向IPGphor3型等電聚焦儀，二相SDS垂直電泳儀，為GE公司生產(chǎn).生產(chǎn)UV1000型紫外／可見光分光光度計為上海天美科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)，以及UMAX2100XL大型掃描儀，雙向電泳圖譜分析軟件Image Master 2D platinum 6.0等.

1.3 蛋白質(zhì)提取方法

1.3.1 裂解液提取法

參照雙向電泳技術(shù)操作手冊［9］建議方法并加以調(diào)整.清理后的蚯蚓表皮組織置于預(yù)冷研缽中，加入9倍體積的裂解液（裂解液A：8 mol／L尿素，4%CHAPS，1%DTT，0.2%Bio-lyte，0.1%蛋白酶抑制劑；裂解液 B：7 mol／L 尿素，2 mol／L 硫脲，4%CHAPS，1%DTT，0.2%Bio-lyte，0.1%蛋白酶抑制劑）和少量石英砂冰上研磨，收集樣品加入1.5 mL EP管，4℃裂解30 min（期間劇烈震蕩3次），在15 000 g（4 ℃）下離心15 min，取上清，－20℃保存.

1.3.2 TCA-丙酮沉淀法

參照Damerval［10］所提到的方法并加以調(diào)整，清理后的蚯蚓表皮組織置于預(yù)冷研缽中，加入9倍體積含1%DTT和10%TCA的丙酮溶液及少量石英砂于冰上碾磨，收集樣品加入1.5 mL EP管，于4℃沉淀過夜，在15 000 g（4℃）下離心30 min.將沉淀重懸于含1%DTT的預(yù)冷丙酮中，－20℃放置1 h后15 000 g（4℃）離心30 min，于通風(fēng)櫥內(nèi)使丙酮充分揮發(fā)，得到干燥的沉淀，15 000 g（4℃）離心1 h，－20℃保存.改良后的TCA－丙酮沉淀法，沉淀加入丙酮清洗的步驟重復(fù)兩次，在丙酮充分揮發(fā)后將沉淀溶解于上樣緩沖液.

所得樣品均參照Bradford蛋白定量法［11］，以牛血清蛋白作為標準蛋白測定樣品蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，用μg／μL表示.

1.4 雙向電泳

1.4.1 第一向固相pH梯度等電聚焦電泳

取經(jīng)過Bradford蛋白定量法確定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的樣品，控制上樣量分別為400，600，800μg用上樣緩沖液補充至450μL，小心加入等電聚焦水化槽，去掉IPG膠條保護膜膠面朝下對準正負極放入水化槽，覆蓋3 mL礦物油后加蓋進行等電聚焦，等電電泳參數(shù)設(shè)置：水化12 h，梯度除鹽250 V×1 h，500 V×1 h，1 000 V×1 h，2 000 V×1 h，4 000 V×1 h，高壓聚焦8 000 V×10 h，保持500 V×1 h.

1.4.2 IPG膠條的平衡

等電聚焦結(jié)束后，IPG膠條依次在平衡液A（6 mol／L尿素，2%SDS，60 mmol／L Tris-HCl pH 8.8，30%甘油，0.001%溴酚藍，1%DTT）和平衡液B（6 mol／L 尿 素，2%SDS，60 mmol／L Tris-HCl pH 8.8，30%甘油，0.001%溴酚藍，2.5%碘乙酰胺）中各平衡15 min，經(jīng)超純水清洗1 s后轉(zhuǎn)移至膠體體積分數(shù)12.5%的二相SDS-PAGE凝膠上端，并用低熔點瓊脂糖封頂.

1.4.3 第二向SDS-PAGE電泳

首先以每塊膠恒定功率5 W電泳2 h，當(dāng)觀察到溴酚藍指示劑由第一向膠條轉(zhuǎn)移到第二向凝膠后加大功率至每塊膠10 W，當(dāng)溴酚藍指示劑接近底部邊緣時停止電泳，電泳全程由冷卻循環(huán)系統(tǒng)控制溫度為20℃.

1.4.4 凝膠染色與掃描

采用考馬斯亮藍染色法［12］，凝膠用超純水清洗3 min，加入750 mol／L固定液（50%甲醇，12.5%冰醋酸）固定1 h，超純水清洗后加入染色液（1.25 g／L考馬斯亮藍R-250，45%甲醇，10%冰醋酸）于搖床內(nèi)染色30 min，染色結(jié)束后用脫色液與搖床內(nèi)（10%甲醇，10%冰醋酸）反復(fù)脫至圖譜清晰，凝膠轉(zhuǎn)移到掃描儀上掃描，最后于含有20%甘油的超純水中保存.

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白質(zhì)提取方法選擇

2.1.1 蛋白質(zhì)得率

兩種裂解液和傳統(tǒng)以及改進后的TCA-丙酮沉淀法蛋白提取樣品總蛋白質(zhì)量濃度，見表1，最高與最低值相差不超過15%，說明4種方法在蛋白提取總量上沒有顯著差距.裂解液提取法蛋白質(zhì)得率相對較低，添加硫脲后提取效果有所提升，但不明顯，改良前的TCA－丙酮沉淀法的蛋白質(zhì)得率最高，改良后蛋白質(zhì)得率略有下降.分析原因為裂解液對蚯蚓組織蛋白質(zhì)的變性能力低于TCA－丙酮沉淀法，在含有尿素的裂解液中添加硫脲，仍然難以溶解分子量較高的蛋白質(zhì)，同時裂解液蛋白酶抑制效果較差，造成了提取過程中蛋白質(zhì)的降解損失，而改良后的TCA－丙酮沉淀法，則是因為增加了丙酮清晰的步驟，導(dǎo)致了少量蛋白質(zhì)的損失.

表1 不同蛋白質(zhì)提取方法樣品蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度Table 1 Protein content extracted by different protein extraction method μg／μL

2.1.2 蛋白質(zhì)提取效果SDS-PAGE分析

不同蛋白質(zhì)提取方法所制備樣品單向SDSPAGE電泳分析結(jié)果，如圖1所示，裂解液提取法樣品蛋白條帶難以辨識，在裂解液中添加硫脲后，在蛋白質(zhì)分子量45 k Da以下出現(xiàn)了部分蛋白條帶，但仍然比較模糊，TCA-丙酮沉淀法樣品蛋白條帶數(shù)量較多，且比較清晰，分布于各個分子量區(qū)間，改良后的TCA-丙酮沉淀法樣品條帶表現(xiàn)效果較改良前更好，實驗結(jié)果與龍峰［13］對于腦脊液的蛋白質(zhì)提取研究類似，分析原因為裂解液所制備樣品鹽離子和脂類等雜質(zhì)含量較高，阻礙了蛋白質(zhì)的變性和溶解，并對電泳造成了影響，而改良后的TCA－丙酮沉淀法雜質(zhì)去除能力相對較好，所制備蛋白質(zhì)樣品更符合雙向電泳的技術(shù)要求.綜上考慮，改良后的TCA－丙酮沉淀法在蚯蚓表皮組織蛋白質(zhì)提取質(zhì)量濃度、提取種類豐富度上，均優(yōu)于裂解液提取法，更適于蚯蚓表皮組織的雙向電泳樣品制備.

圖1 不同蛋白提取方法樣品SDS-PAGE電泳圖譜Fig.1 SDS-PAGE pattern of Eiseniafetida protein samples extracted by four methods

2.2 蚯蚓蛋白質(zhì)的雙向電泳

2.2.1 不同pH范圍IPG膠條雙向電泳

IPG膠條pH范圍的優(yōu)化原則是先寬后窄，pH范圍較寬的膠條，可用于確定樣品中蛋白質(zhì)分布的大體規(guī)律，然后選取符合目標生物蛋白質(zhì)等電點主要分布區(qū)域的窄pH范圍IPG膠條，提高低豐度蛋白點和重疊蛋白點的分辨率［14］.選用pH 3～10的24 cm IPG膠條進行雙向電泳所得圖譜，如圖2（a）所示，蛋白點分離效果不明顯，大部分蛋白點集中于膠上pH 4～7的區(qū)域內(nèi)，蛋白點重疊情況嚴重，難以分辨，可知蚯蚓表皮組織蛋白質(zhì)等電點主要分布在4～7之間，為了提升這一區(qū)間內(nèi)蛋白點的分離效果，選用pH 4～7的IPG膠條進行雙向電泳，如圖2（b）所示，蛋白質(zhì)等電聚焦效果明顯增強，原本聚集在pH 3～10 IPG膠條等電點4～7之間的蛋白點也能獲得較好的分離，且低豐度蛋白丟失的情況明顯減少，分辨率有很大改善.因此，為提升蚯蚓表皮組織雙向電泳圖譜蛋白點分辨率，應(yīng)選用24 cm pH 4～7的IPG膠條.從圖2（b）中還發(fā)現(xiàn)，等電點酸性端的蛋白質(zhì)分布較少，而在堿性端上發(fā)現(xiàn)因為IPG膠條pH范圍不足而無法繼續(xù)聚焦的蛋白點，可見蚯蚓表皮組織蛋白質(zhì)中存在一定強堿性蛋白質(zhì)，為了進一步提升雙向電泳圖譜上的信息量，在后續(xù)的研究中可選擇擴大IPG膠條的堿性pH范圍，或者選擇寬等電點范圍非線性梯度IPG膠條.2.2.2 不同上樣量對雙向電泳的影響

圖2 蚯蚓蛋白質(zhì)樣品不同pH梯度范圍IPG膠條雙向電泳圖譜Fig.2 2-DE patterns of Eiseniafetida extracts using different pH gradient IPG strips

圖3 蚯蚓蛋白質(zhì)樣品不同上樣量雙向電泳圖譜Fig.3 2-DE patterns of Eiseniafetida extracts with different loading sample quantity

上樣量直接影響電泳圖譜上的蛋白點的分辨效果，整個雙向電泳技術(shù)流程具有高度復(fù)雜性，上樣量的大小還與膠條長度，pH范圍，染色方法有關(guān).保持其他電泳參數(shù)不變，對上樣量分400，600，800μg 3個梯度進行考察，所得圖譜見圖3.當(dāng)上樣量為400μg時，如圖3（a）所示，蛋白點稀少，只檢測出（187±20）個蛋白點，分析原因為上樣量過低，電泳中部分蛋白質(zhì)無法成功從第一向轉(zhuǎn)移至第二向，而低豐度的蛋白無法染色和分析，導(dǎo)致大量蛋白點的丟失；當(dāng)上樣量為600μg時，如圖3（b）所示，分離效果有了明顯改善，共檢測出（629±20）個蛋白點，為檢測數(shù)最多，且背景清晰，蛋白點重疊較少；當(dāng)上樣量為800μg時，如圖3（c）所示，低豐度的蛋白點表現(xiàn)較好，但是在電泳圖譜蛋白分子量45～99 k Da和等電點5～6之間出現(xiàn)大量高豐度蛋白點的橫向條紋，且蛋白點重疊的現(xiàn)象非常嚴重，電泳背景較深，導(dǎo)致此區(qū)域蛋白點相互干擾，檢測結(jié)果誤差增大，蛋白點檢測數(shù)為（524±20）個，分析原因為上樣量過高，導(dǎo)致第一向等電聚焦負擔(dān)加重，且雜質(zhì)含量增加，造成蛋白點等電分離不完全［15］.綜合考慮，采用考馬斯亮藍染色方法時，為盡可能提高低豐度蛋白點的表現(xiàn)效果的同時不影響等電聚焦和圖譜背景，應(yīng)選擇600μg為最佳上樣量.

2.2.3 蚯蚓雙向電泳體系重復(fù)性驗證

圖4 蚯蚓蛋白質(zhì)樣品3次雙向電泳所得圖譜Fig.4 2-DE patterns of Eiseniafetida extracts for 3 times

蚯蚓組織蛋白質(zhì)樣品以相同實驗條件（采用TCA-丙酮沉淀法制備樣品，IPG膠條選擇24 cm pH 4～7，上樣量為600μg，凝膠采用考馬斯亮藍染色）分別進行三次雙向電泳，所得圖譜如圖4（a—c）所示，三張電泳圖譜蛋白點檢測數(shù)均大于600.利用Image Master2D軟件對圖譜進行分析，將三張圖譜合成為為一張合成圖譜，作為參考膠，三張圖譜和參考膠蛋白點的平均配對率達到83%以上.從實驗結(jié)果可知，此雙向電泳體系所得蚯蚓表皮組織蛋白質(zhì)組電泳圖譜蛋白點信息量大，分辨率高，同時具有較高的重復(fù)性，可以滿足蚯蚓蛋白質(zhì)組學(xué)分析研究的要求.

3 結(jié) 論

建立了適用于蚯蚓表皮組織的雙向電泳技術(shù)體系，具體方法和參數(shù)設(shè)置：采用改良的TCA－丙酮沉淀法對蚯蚓表皮組織進行蛋白質(zhì)提取，選擇長度24 cm pH梯度范圍為4～7的IPG膠條進行等電電泳，選用考馬斯亮藍染色法作為凝膠染色方法時，最適上樣量為600μg，所得雙向電泳圖譜利用Image Master2D分析可檢測蛋白點達（629±20）個.重復(fù)性實驗結(jié)果表明，該方法所得電泳圖譜蛋白點清晰，背景較低，且重復(fù)性好，能夠滿足蚯蚓蛋白質(zhì)組學(xué)研究的需要.

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Establishment and optimization of two-dimensional gel electrophoresis technology system for earthwormEiseniafetidaepithelium proteome

WU Shi-jin，ZHAO Shi-liang，SHEN Fei-chao，XU Min
（College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China）

In order to establish and optimize two-dimensional electrophoresis（2-DE）technology system for earthwormEiseniafetidaepithelium proteome，sample preparation method，loading quantity of samples，appropriate IPG strips and system repetition were studied.The results showed that，compared with the lysis buffer extraction method，TCA-A extraction method could increase the protein extracting efficiency up to 12.49μg／μL.While the 24 cm IPG strip（pH 4～7）and 600μg loading sample quantity were considered to be the optimal condition for 2-DE analysis of earthwormEiseniafetidaepithelium proteome，up to（629±20）protein spots can be detected on the gel after coomassie brilliant blue R-250 staining，repeatability of the system also turned out to be good.Therefore，the high resolution and repeatable 2-DE technology system could be wildely used in proteome study of earthwormEisenia fetida.

Eiseniafetida；proteome；TCA-A；two-dimensional electrophoresis；optimization

Q503

A

1006-4303（2013）02-0156-05

2012-03-09

國家自然科學(xué)基金資助項目（20977087）；浙江省自然科學(xué)基金資助項目（Y5090054）；浙江省公益技術(shù)研究社會發(fā)展項目（2010C33G2020078）

吳石金（1971—），男，江西贛州人，教授，博士，研究方向為蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，E-mail：wujan28＠zjut.edu.cn.

（

陳石平）