王 笑，侯曉蓉，王建偉，申屠超，單偉光

（1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310032；2.浙江樹人大學(xué)，浙江 杭州 310015）

基于荷移反應(yīng)的HPLC法測定L－半胱氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)

王 笑1，侯曉蓉1，王建偉1，申屠超2，單偉光1

（1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310032；2.浙江樹人大學(xué)，浙江 杭州 310015）

建立基于荷移反應(yīng)的L－半胱氨酸高效液相色譜（HPLC）定量方法.在pH 9.0的硼酸－硼砂緩沖溶液中，L-半胱氨酸與四氯苯醌于40℃水浴中恒溫30 min，形成絡(luò)合物（λmax＝358 nm），采用高效液相色譜進行分析.結(jié)果表明：L-半胱氨酸與四氯苯醌形成了摩爾比為1∶1型穩(wěn)定絡(luò)合物.另外，L-半胱氨酸在5～100μg／mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系；低、中、高3個質(zhì)量濃度的加樣回收率分別為99.2%，99.1%和96.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.3%，1.4%和1.3%.本方法準(zhǔn)確、快速、簡便且重復(fù)性良好，適用于L－半胱氨酸原料藥的定量分析.

荷移反應(yīng)；高效液相色譜；L-半胱氨酸；四氯苯醌

半胱氨酸是一種天然的，含有一個巰基基團的氨基酸，其類似物在一些生物進程中起著不可忽視的作用［1］.國內(nèi)外研究表明半胱氨酸有多種生物學(xué)作用，參與許多重要的細(xì)胞代謝過程，包括蛋白質(zhì)合成、解毒和新陳代謝等.缺乏半胱氨酸容易引起一系列綜合癥，包括兒童生長緩慢、頭發(fā)脫色、水腫、肝損傷、皮膚病變等［2－3］.因此，半胱氨酸的質(zhì)量控制方法有待進一步探索.

目前，測定半胱氨酸含量的方法主要有柱前衍生化 HPLC－MC［4］、毛細(xì)管電泳法［5］、熒光法［6－9］、電化學(xué)測定法［10］和伏安法［11－12］等.由于 L－半胱氨酸在紫外區(qū)無吸收，故在HPLC檢測中主要采用熒光檢測器.荷移光譜法提出于20世紀(jì)50年代，是根據(jù)Mulliken［13］在量子化學(xué)基礎(chǔ)上提出的電荷轉(zhuǎn)移理論發(fā)展起來的一種分析方法，并于1972年作為一個標(biāo)題引入化學(xué)文獻(xiàn).它利用含有能夠提供電子的n-電子基團或π－電子基團的藥物與電子受體試劑形成荷移絡(luò)合物.生成的荷移絡(luò)合物往往在紫外或可見區(qū)具有特定的吸收峰，利用這些特性可以建立起荷移光譜法來測定藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù).由于荷移絡(luò)合物的形成，使吸收光譜發(fā)生較大幅度的紅移，從而避開藥物制劑或體液中其他物質(zhì)的干擾，使其選擇性顯著提高，所以近年來荷移光譜法在藥物分析方面得到廣泛的應(yīng)用.

將電子荷移理論引入高效液相色譜法的柱前衍生化，并研究了L－半胱氨酸與四氯苯醌形成荷移絡(luò)合物的條件，建立了基于荷移反應(yīng)的高效液相色譜法測定L－半胱氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的新方法.該方法操作條件易得、準(zhǔn)確、快速、簡便且重復(fù)性好，利用普遍應(yīng)用于分析測試的UV檢測器，干擾少，選擇性高，結(jié)果令人滿意，可用于測定L－半胱氨酸原料藥的質(zhì)量分?jǐn)?shù).目前基于荷移反應(yīng)的半胱氨酸高效液相色譜法測定方法還未見文獻(xiàn)報道，該方法也為無紫外吸收的該類藥物的高效液相色譜法測定提供了新方法.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀（配備G1314紫外檢測器，G1311A在線脫氣裝置，G1329A進樣器）（美國Agilent公司）；UV-2450紫外／可見分光光度儀（日本Shimadzu公司）；ZNHW-II型精密電子控制儀（杭州大衛(wèi)科教儀器有限公司）.

L－半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（98.5%，上海國藥試劑公司）；四氯苯醌（TCBQ）、對苯醌（p-BQ）、2，3-二氯－5，6-二氰對苯醌（DDBQ）為化學(xué)純；無水乙醇、醋酸、硼砂、硼酸、磷酸氫二鈉、檸檬酸為分析純；甲醇為色譜純；實驗用水均為二次蒸餾水.

1.2 溶液制備

L－半胱氨酸對照品溶液.準(zhǔn)確稱取L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品0.050 0 g，溶于50 mL蒸餾水，制得1 000 mg／L的對照品儲備液.使用時稀釋至所需質(zhì)量濃度.

TCBQ溶液.準(zhǔn)確稱取四氯苯醌0.024 6 g，超聲輔助溶于100 mL蒸餾水，制得1.0 mmol／L四氯苯醌溶液.

緩沖溶液.準(zhǔn)確配制19.07 g／L硼砂溶液和12.37 g／L 硼酸溶液，取硼砂溶液8.0 mL 加入2.0 mL硼酸溶液中，制得pH 9.0的緩沖溶液.

1.3 實驗方法

在10 mL比色管中依次加入1 mL L－半胱氨酸溶液，1 mL的硼砂－硼酸緩沖溶液（pH 9.0）和2 mL四氯苯醌溶液（1.0 mmol／L），用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，置于40℃水浴中反應(yīng)30 min后，迅速冷卻至室溫，用高效液相色譜進行分析.

樣品分離采用Agilent?Eclipse XDBTMC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），柱溫25℃.流動相組成為30%甲醇和70%三乙胺水溶液（0.005%），流速1.0 mL／min.檢測波長為358 nm，進樣體積為10μL.在上述條件下，L-半胱氨酸和絡(luò)合物的保留時間分別為2.4 min和6.5 min.

2 結(jié)果與討論

2.1 L-半胱氨酸與TCBQ的反應(yīng)

L-半胱氨酸與三種荷移試劑（TCBQ，p-BQ，DDBQ）的荷移反應(yīng)表明，L-半胱氨酸與TCBQ發(fā)生荷移反應(yīng)的靈敏度最高，因此本實驗采用TCBQ作為荷移試劑.根據(jù)TCBQ的紫外吸收光譜（圖1），其在287 nm處具有最大吸收；而L－半胱氨酸與TCBQ反應(yīng)后，在相同條件下的最大吸收波長變化為358 nm，發(fā)生了紅移現(xiàn)象，說明兩者之間發(fā)生了反應(yīng)，形成了在紫外區(qū)具有特征吸收峰的穩(wěn)定荷移絡(luò)合物.

圖1 四氯苯醌和荷移絡(luò)合物的紫外吸收光譜Fig.1 Absorption spectra of TCBQ and charge transferring complex

在相同條件下，選用甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、二甲基亞砜和水為溶劑進行試驗.結(jié)果顯示：L-半胱氨酸和TCBQ在水中反應(yīng)最完全，色譜峰面積最大.因此，選用水為溶劑.在上述實驗條件下，利用高效液相色譜檢測參比溶液和該荷移絡(luò)合物，得到如圖2所示的液相色譜圖.

圖2 荷移絡(luò)合物的液相色譜圖Fig.2 HPLC spectra of charge transferring complex

2.2 反應(yīng)條件的影響和優(yōu)化

反應(yīng)pH 采用硼砂－硼酸（pH 7.0～9.0）和碳酸鈉-碳酸氫鈉（pH 10.0～11.0）緩沖液控制.實驗結(jié)果表明：L-半胱氨酸與TCBQ在pH 9.0時具有最高的反應(yīng)率，并且在該pH下，反應(yīng)具有較高的靈敏度，且峰面積穩(wěn)定.同時，該體系對反應(yīng)影響小.

在不同的緩沖液用量下，反應(yīng)所得的絡(luò)合物峰面積大小幾乎保持恒定.因此，反應(yīng)體系選用pH 9.0的硼砂－硼酸緩沖體系（0.2 mol／L），用量為1 mL.

反應(yīng)的溫度對絡(luò)合物的形成與穩(wěn)定沒有顯著的影響，在40～50℃范圍內(nèi)，反應(yīng)效率略高.而反應(yīng)時間對絡(luò)合物的形成有顯著影響，反應(yīng)經(jīng)過30 min后，絡(luò)合物的峰面積大小基本趨于穩(wěn)定.故選擇的反應(yīng)溫度為40℃，反應(yīng)時間為30 min.

另外，還考察了TCBQ用量對反應(yīng)的影響.結(jié)果表明：TCBQ溶液（1.0 m mol／L）的用量在1.5～4.0 mL內(nèi)，反應(yīng)完全，且TCBQ用量對測定幾乎無影響.因此，選用TCBQ用量為2.0 mL.

2.3 方法學(xué)驗證

待反應(yīng)完成后，用HPLC測定不同放置時間的反應(yīng)液.結(jié)果表明，反應(yīng)液中荷移絡(luò)合物穩(wěn)定性良好，放置12 h后，峰面積沒有明顯變化；7 d的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差僅為5.4%.

標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示，將數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理得回歸方程A＝13.544C（其中A為峰面積，C為L－半胱氨酸的質(zhì)量濃度），線性相關(guān)系數(shù)r2＝0.999 7，線性范圍為0～100 mg／L.最低檢測限為0.2 mg／L；最低定量限為1.0 mg／L.

根據(jù)HPLC測定，L-半胱氨酸在原料藥中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.7%.另外，該方法的回收率及精密度采用加樣法檢測，結(jié)果見表1.

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve

表1 樣品的回收率及精密度測定結(jié)果（n＝5）Table 1 Determination results of recovery and RSD of sample（n＝5）

2.4 絡(luò)合物組成和穩(wěn)定常數(shù)測定

用連續(xù)變化法（圖4a）和摩爾比法（圖4b）測定絡(luò)合物的組成，其中C1和C2分別為L－半胱氨酸和TCBQ物質(zhì)的量濃度，測得L－半胱氨酸與TCBQ的絡(luò)合摩爾比為1∶1.L－半胱氨酸分子中N原子上有一孤對電子對可作為電子供體，而TCBQ作為n電子受體，在水中可形成n-π型絡(luò)合物.基于測得的絡(luò)合物組成摩爾比為1∶1，荷移反應(yīng)式為

圖4 檢測絡(luò)合物穩(wěn)定性Fig.4 The stability of charge transferring complex

用稀釋法測定絡(luò)合物的穩(wěn)定常數(shù)，在兩個不同的L－半胱氨酸和TCBQ總摩爾數(shù)條件下，在同一坐標(biāo)上分別作對兩個不同總摩爾分?jǐn)?shù)溶液的吸光度曲線（曲線Ⅰ和曲線Ⅱ），其中X v表示四氯苯醌的摩爾數(shù)和溶液總摩爾數(shù)的比值，在這二條曲線上找出吸光度相同的二點，如圖5所示，則在此二點上對應(yīng)的溶液的絡(luò)合物濃度應(yīng)相同，由此得出絡(luò)合物穩(wěn)定常數(shù)K＝2.887×103／（mol·L）.

圖5 吸光度－溶液組成圖Fig.5 Spectrophotometry-solution composition

3 結(jié) 論

根據(jù)本實驗可知：基于荷移反應(yīng)的L-半胱氨酸高效液相色譜定量法，操作簡便、可靠且靈敏度高，可用于L-半胱氨酸原料藥的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定及其合成工藝中的中間控制.

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Quantification of L-cysteine by HPLC based on charge transfer reaction

WANG Xiao1，HOU Xiao-rong1，WANG Jian-wei1，SHEN-TU Chao2，SHAN Wei-guang1
（1.College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China；2.Zhejiang Shuren University，Hangzhou 310015，China）

A method of high performance liquid chromatography（HPLC）was established for quantification of L-cysteine based on charge transfer reaction. L-cysteine reacts with tetrachloroquinone in pH 9.0 borax-boric acid buffer at 40℃for 30 min，forming a complex（λmax＝358 nm），which could be detected using HPLC.The results indicated that stable complex formed with an L-cysteine／tetrachloroquinone molar ratio of 1∶1.Moreover，the determination fell into an excellent linear relation in the range of 10～150μg／mL.The recoveries were 99.2%，99.1%and 96.5%，and the relative standard deviations（RSD）were 1.3%，1.4%and 1.3%for low，middle and high three kinds added，respectively.This method is accurate，quick，simple and reproducible and can be used to quantify L-cysteine in crude drug.

charge transfer reaction；high performance liquid chromatography （HPLC）；L-cysteine；tetrachloroquinone

R917

A

1006-4303（2013）02-0152-04

2012-03-12

浙江省自然科學(xué)基金資助項目（Y2080137）；浙江省科技廳公益計劃研究社會發(fā)展項目（2011C23006）

王 笑（1988—），女，浙江東陽人，碩士研究生，研究方向為儀器分析，E-mail：hoverxiaoxiao＠hotmail.com.通信作者：單偉光教授，E-mail：swg＠zjut.edu.cn.

（

陳石平）